樊慶琦 黃承彥 解樹斌 隋新霞 崔德周 李永波 楚秀生

摘要：

小麥葉綠素含量與產(chǎn)量密切相關(guān)，而SPAD值與葉綠素含量呈顯著正相關(guān)。本文以保存的189份山東省小麥種質(zhì)資源為研究對象，測定缺鐵脅迫下小麥苗期葉片的SPAD值，并進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）。結(jié)果表明，正常培養(yǎng)條件下，SPAD值均值為39.18，變幅為28.33～48.19；缺鐵脅迫條件下，SPAD值均值為3.56，變幅為0.07～12.87；脅迫指數(shù)均值為-90.89，變幅為-99.83～-68.06，品種間存在極顯著差異。利用可變類平均法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，歐式距離為10時，可劃分為5大類群。根據(jù)不同類群缺鐵脅迫SPAD值和脅迫指數(shù)的變化特點，供試小麥材料可分為鐵耐受型、中間型和敏感型。全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，在正常處理下，檢測到與SPAD值顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點23個，分布于1A、2A、2D、3A、3B、4A、4B、4D、5A、5D、6A、6B、6D和7B等染色體上，其中在3B染色體上檢測到4個顯著的SNPs位點，可能存在與葉綠素含量相關(guān)的基因。對于鐵耐受型小麥材料的利用，有助于小麥產(chǎn)量和適應(yīng)性相關(guān)性狀的遺傳改良；對關(guān)聯(lián)SNPs位點的深入研究，有利于深入了解鐵與小麥葉綠素合成和調(diào)控的遺傳機(jī)制。

關(guān)鍵詞：小麥；缺鐵脅迫；SPAD值；全基因組關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號：S512.101 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2018）08-0012-07

Effects of Iron Deficiency Stress on Chlorophyll Content and

GWAS Analysis of SPAD Value in Wheat Seedling Stage

Fan Qingqi1， Huang Chengyan1， Xie Shubin2， Sui Xinxia1， Cui Dezhou1， Li Yongbo1，Chu Xiusheng1

（1. Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Key Laboratory of Wheat Biology & Genetic Improvement on North Yellow & Huai River Valley，

Ministry of Agriculture/National Engineering Laboratory for Wheat & Maize， Jinan 250100， China；

2. Shandong Luyan Agricultural Seeds Co.， Ltd.， Jinan 250100， China）

Abstract The content of chlorophyll in wheat is closely related to yield， while soil plant analyatical development （SPAD） value is positively correlated with chlorophyll content. In this research， 189 wheat germplasms from Shandong Province were selected as the research objects， the SPAD value of leaf blade at seedling stage was determined and the genome-wide association analysis （GWAS） was also carried out. The results showed that under normal culture treatment， the SPAD value ranged from 28.33 to 48.19 with a mean value of 39.18. Under iron deficiency treatment， the SPAD value ranged from 0.07 to 12.87 with a mean value of 3.56. The stress index （SI） ranged from -99.83 to -68.06 with a mean value of -90.89. There were significant differences in the tested materials. All the tested materials were divided into five groups using variable class average systematic clustering when the Euclidean distance was 10. And they also could be divided into resistant type， middle type and sensitive type based on the characters of SPAD value in different groups. GWAS showed that total 23 single nucleotide polymophisms （SNPs） associated with SPAD value distributed on the wheat chromosomes 1A， 2A， 2D， 3A， 3B， 4A， 4B， 4D， 5A， 5D， 6A， 6B， 6D and 7B， respectively. Four SNPs which were located on chromosome 3B might be related to chlorophyll content. The utilization of iron tolerant wheat germplasms could help to improve the genetic improvement of wheat yield and adaptability， and in-depth study on the correlation SNPs site would be helpful to understand the genetic mechanism of the synthesis and regulation of chlorophyll.

Keywords Wheat； Iron deficiency stress； SPAD value； GWAS

葉綠素作為光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，可將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，對植物的生長發(fā)育至關(guān)重要。在小麥等作物中，籽粒產(chǎn)量的70%～90%來自于光合作用[1，2]。小麥中的葉綠素主要包括葉綠素a和葉綠素b，其含量直接影響光合效率[3，4]。日本農(nóng)林水產(chǎn)省開發(fā)的SPAD便攜式葉綠素測定儀，基于650 nm和940 nm光學(xué)濃度差的原理，測定植物葉片葉綠素相對含量。SPAD值與葉綠素含量呈乘冪關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.94[5]，與葉綠素含量呈顯著正相關(guān)，為葉綠素含量的測定提供了簡捷、快速的工具，廣泛應(yīng)用于小麥等作物SPAD值與產(chǎn)量、品質(zhì)和氮素營養(yǎng)方面的研究[6-12]。

葉綠素含量與植物的營養(yǎng)狀況密切相關(guān)。鐵雖然不是葉綠素的組分，但卻參與葉綠素的合成。植物體內(nèi)80%的鐵存在于葉綠體內(nèi)，鐵含量與葉綠素含量呈現(xiàn)良好的正相關(guān)。鐵影響葉綠體的構(gòu)造，而葉綠體則是葉綠素合成的先決條件[13]。

植物缺鐵時，細(xì)胞中葉綠素合成數(shù)量和質(zhì)量均明顯下降，葉綠體變小，外表不清晰，片層系統(tǒng)無法垛疊形成基粒。缺鐵嚴(yán)重時，可導(dǎo)致細(xì)胞膜變薄、細(xì)胞壁疏松、膜囊系統(tǒng)破壞，胞內(nèi)細(xì)胞器如類囊體、葉綠體解體或液泡化，高爾基體膨脹等[14-17]。植物缺鐵常常出現(xiàn)新葉黃化失綠現(xiàn)象，嚴(yán)重時整株葉片呈黃綠色，并出現(xiàn)一些小型干枯斑點，幼葉葉脈間形成缺綠條紋或整片葉發(fā)白，主葉不出，不能抽穗，老葉則常早枯[18]，植株生長遲緩，嚴(yán)重影響植物的正常生長發(fā)育。

隨著QTL定位及全基因組關(guān)聯(lián)分析在小麥中的廣泛應(yīng)用，開展小麥葉綠素相關(guān)基因的研究，對提高小麥產(chǎn)量潛力具有重要意義。Czyczyo-Mysza等[19]對葉綠素?zé)晒馓匦赃M(jìn)行了QTL定位研究，發(fā)現(xiàn)116個QTL位于除7B染色體以外的染色體上?？傮w而言，目前關(guān)于此類研究仍相對較少。

山東省是我國小麥主產(chǎn)區(qū)，常年播種面積366.67×104 hm2，面積約占全國的1/7，但總產(chǎn)卻占到了全國的1/6～1/5。山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所保存了自20世紀(jì)50年代以來的小麥地方品種、審定品種和其它種質(zhì)資源，是重要的小麥基因庫[20]。然而，對于這些保存的小麥種質(zhì)資源缺鐵脅迫下葉綠素含量的遺傳演變研究以及全基因組關(guān)聯(lián)分析，至今仍未開展。本試驗以保存的山東省小麥地方品種、審定品種和其它種質(zhì)資源為研究對象，利用SPAD葉綠素測定儀，考察苗期缺鐵脅迫下葉綠素含量在品種間的差異和變化規(guī)律，為小麥種質(zhì)資源的評價和創(chuàng)新利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥試驗材料189份，包括地方品種、審定品種和其它種質(zhì)資源，其中，地方品種27份，20世紀(jì)50年代育成品種10份，60年代育成品種4份，70年代育成品種8份，80年代育成品種12份，90年代育成品種15份，21世紀(jì)初育成品種46份，2010年后育成品種18份，其它種質(zhì)資源49份（表1）。

1.2 營養(yǎng)液培養(yǎng)及數(shù)據(jù)采集

挑選每份材料籽粒飽滿的種子10粒，3次重復(fù)。種子經(jīng)1.5%次氯酸鈉消毒5 min后，腹溝朝下，均勻擺放至珍珠棉和紗網(wǎng)縫制的發(fā)芽盤內(nèi)，然后將其放入盛有1 L超純水的培養(yǎng)盒（15 mm×15 mm×20 mm）中，在人工智能溫室中發(fā)芽，光周期為光照16 h/黑暗8 h，光強(qiáng)12 000 lx，溫度25℃，3天換水1次。

種子發(fā)芽7天后，仔細(xì)將種子從幼苗根部去除，加入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。其中，對照處理營養(yǎng)液配方為：0.7 mmol/L K2SO4，0.1 mmol/L KCl，2 mmol/L Ca（NO3）2 ，0.5 mmol/L MgSO4，0.1 mmol/L KH2PO4，1 μmol/L H3BO4，0.5 μmol/L MnSO4，0.2 μmol/L CuSO4，0.5 μmol/L ZnSO4，0.01 μmol/L （NH4）6Mo7O24，100 μmol/L FeEDTA。缺鐵脅迫營養(yǎng)液配方除無FeEDTA外，其余如對照處理。營養(yǎng)液3天換1次，小麥培養(yǎng)至三葉一心時，利用SPAD-502葉綠素儀測定倒三葉中部，重復(fù)3次，重復(fù)間SPAD值相差不超過0.5。

根據(jù)正常和缺鐵培養(yǎng)條件下的SPAD值計算脅迫指數(shù)，公式如下：

SI=XFe--XFe+XFe+×100% 。

式中，SI為脅迫指數(shù)；XFe-為材料缺鐵脅迫培養(yǎng)的SPAD值；XFe+為材料正常培養(yǎng)的SPAD值。

1.3 660K芯片的SNP檢測

每份供試小麥材料取5粒種子混合，送至北京康普森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Affymetrix wheat 660K芯片檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行SPAD值的數(shù)據(jù)計算和圖表制作；利用DPS 10.65高級版進(jìn)行方差分析和聚類分析。660K SNP芯片使用Affymetrix的軟件APT1.17.0和SNPolisher 1.5.0進(jìn)行分型，剔除分型成功率小于90%的SNP位點，質(zhì)控后的數(shù)據(jù)采用TASSEL軟件的線性模型（GLM）進(jìn)行正常和缺鐵脅迫下的SPAD值以及脅迫指數(shù)的GWAS分析，以Bonferroni校正顯著性閾值（P值）。

P=0.05/質(zhì)控后的SNP數(shù)目

低于此閾值的SNPs，認(rèn)為與表型顯著關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理SPAD值及脅迫指數(shù)的方差分析

在正常處理條件下，供試小麥材料的SPAD值均值為39.18，方差為13.53，變異系數(shù)為27.18%，材料間呈極顯著差異；缺鐵脅迫條件下，SPAD值僅為3.56，遠(yuǎn)低于正常值，方差為6.42，變異系數(shù)為39.48%，材料間也呈極顯著差異。就脅迫指數(shù)而言，所有材料均表現(xiàn)為負(fù)值，均值為-90.89，方差為40.80，變異系數(shù)為15.66%，材料間亦存在極顯著差異（表2）。由此可知，一方面，供試小麥材料在正常營養(yǎng)供應(yīng)條件下，品種間的葉綠素含量存在極顯著差異；另一方面，缺鐵脅迫嚴(yán)重阻礙了葉綠素的合成，SPAD值顯著下降，變異系數(shù)顯著增加，表明缺鐵脅迫下不同品種葉綠素含量差異更大。此外，脅迫指數(shù)也存在品種間的差異，但變異幅度較前兩者小。

2.2 SPAD值的聚類分析

根據(jù)脅迫指數(shù)，利用可變類平均法對189份小麥試驗材料進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，當(dāng)歐式距離為10時，供試材料可分為5大類群（圖1）。每個類群在不同處理下的SPAD值及脅迫指數(shù)的平均值見表3。

第1類群包含碧瑪1號、濟(jì)南13、汶農(nóng)5號等41個品種，占供試小麥材料的21.69%。該類群正常條件下SPAD值的平均值為35.11，缺鐵脅迫條件下平均值為2.39。

第2類群包含錢交麥、魯麥1號、魯麥20、萊州137、濟(jì)南18等24個品種，占供試小麥材料的12.70%。正常和脅迫處理下，SPAD值的平均值分別為35.42和5.31。

第3類群包含泰山1號、魯麥14、煙農(nóng)15、濟(jì)麥22等62個品種，占供試小麥材料的32.80%。正常和脅迫處理下，SPAD值的平均值分別為41.87和3.67。

第4類群包含濟(jì)南8號、濟(jì)南16、萊州953等41個品種，占供試小麥材料的21.69%。

正常和脅迫處理下，SPAD值的平均值分別為40.10和0.93。

第5類群包含山農(nóng)664、山農(nóng)21、山農(nóng)22、山農(nóng)24等21個品種，占供試小麥材料的11.11%。正常和脅迫處理下，SPAD值的平均值分別為41.63和8.69。

這5大類群SPAD值平均值的大小順序，正常處理下為3>5>4>2>1，缺鐵脅迫處理下為5>2>3>1>4；脅迫指數(shù)的大小順序為5>2>3>1>4。綜合分析，第5和第2類群在缺鐵脅迫下SPAD值和脅迫指數(shù)均相對較高，表明在缺鐵條件下，這兩個類群的小麥品種仍具有葉綠素合成的能力，為缺鐵耐受型品種。第4類群的小麥品種雖然正常處理下SPAD值表現(xiàn)較高，但在缺鐵脅迫下，SPAD值接近零，表現(xiàn)為在缺鐵條件下基本不具備合成葉綠素的能力，為缺鐵敏感型品種。第1類和第3類群則屬于中間類型。

2.3 不同反應(yīng)類型小麥品種的演變

依據(jù)上述分析劃分的對缺鐵脅迫的反應(yīng)類型，統(tǒng)計各來源小麥品種的類型分布，結(jié)果見表4?？梢钥闯?，小麥地方品種、20世紀(jì)50年代以及70年代的品種以中間類型為主；80年代和90年代耐受型品種的比例增加明顯，分別為41.67%和46.67%，但80年代仍主要以中間型品種為主；進(jìn)入21世紀(jì)后，耐受型品種的比例又有所下降，分別為28.26%和22.22%，以中間型品種為主，占比均超過50%。

2.4 SPAD值的GWAS分析

189份小麥樣品的SNP數(shù)據(jù)，剔除分型成功率小于90%的染色體位點34 472個，剔除較小等位基因頻率小于0.05的染色體位點176 659個，質(zhì)控后的SNP數(shù)目為419 383個，以Bonferroni校正的5%基因組水平顯著的P值閾值為1.1922×10-7（0.05/419383）。低于該閾值則認(rèn)為與表型顯著關(guān)聯(lián)。正常和缺鐵脅迫條件下的manhattan圖和QQ-plot圖見圖2。

根據(jù)結(jié)果，缺鐵脅迫下的SPAD值和脅迫指數(shù)均未檢測到顯著SNPs，正常培養(yǎng)條件下，檢測到23個顯著SNPs。

統(tǒng)計顯著SNPs在染色體的位置，發(fā)現(xiàn)有20個分布在1A、2A、2D、3A、3B、4A、4B、4D、5A、5D、6A、6B、6D和7B染色體，另3個SNPs在染色體上的位置未知。其中，在3B染色體上發(fā)現(xiàn)4個顯著SNPs，該染色體可能存在與葉綠素合成有關(guān)的基因?？梢?，與葉綠素合成或調(diào)控有關(guān)的基因廣泛分布于小麥染色體組。

3 討論

SPAD值不僅與葉綠素含量具有良好的顯著正相關(guān)關(guān)系[5]，還與小麥氮素養(yǎng)分高效密切相關(guān)[7，9，10]。由于葉綠素含量與產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素也呈顯著正相關(guān)關(guān)系[21]，因此，可以通過SPAD值獲得的小麥生長發(fā)育過程中的葉綠素含量信息，進(jìn)一步評估小麥的營養(yǎng)發(fā)育狀況。

根據(jù)本研究結(jié)果，供試小麥材料在缺鐵脅迫下，SPAD值嚴(yán)重下降，有的甚至接近零，表明鐵元素作為葉綠素合成的必需元素，其營養(yǎng)狀態(tài)對葉綠素的合成和小麥的正常生長發(fā)育至關(guān)重要。

無論在正常情況下還是缺鐵脅迫下，SPAD值存在品種間的差異，這種差異可能是基于基因型的差異所導(dǎo)致。根據(jù)系統(tǒng)聚類，第2類群和第5類群的SPAD值在正常和脅迫處理條件下均較高，表明這兩類群中的小麥品種具有較好的缺鐵耐受能力。從品種的演變來看， 20世紀(jì)80、90年代，耐受型小麥品種的比例大幅增加，而敏感型品種的比例顯著下降，表明這段時期選育的小麥品種較耐缺鐵脅迫，葉綠素合成能力較強(qiáng)。處于第5類群的現(xiàn)代小麥品種，如山農(nóng)22、菏麥19等，SPAD值在正常培養(yǎng)條件下分別達(dá)到40.29和45.22，在缺鐵脅迫下分別為12.87和9.79，說明其缺鐵耐受能力較強(qiáng)，在缺鐵脅迫下仍能維持部分葉綠素合成；且這些品種農(nóng)藝性狀優(yōu)良，產(chǎn)量水平較高，可以作為重要的骨干親本加以利用。

SPAD值全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，與之關(guān)聯(lián)的顯著SNPs廣泛存在于小麥基因組中，且有4個顯著SNPs位于3B染色體，可能該染色體上存在葉綠素合成相關(guān)基因。本研究結(jié)果與Czyczyo-Mysza等[19]對葉綠素?zé)晒馓匦缘难芯拷Y(jié)果一致，表明葉綠素的合成具有復(fù)雜的遺傳機(jī)制，是眾多基因參與的結(jié)果。

在下一步的研究中，首先，將利用缺鐵脅迫條件下SPAD值表現(xiàn)較高的現(xiàn)代小麥品種，培育葉綠素含量高、對缺鐵耐受力強(qiáng)的小麥新品種；其次，利用本研究發(fā)現(xiàn)的SNPs位點進(jìn)行有關(guān)分子機(jī)理研究，驗證上述SNPs在小麥體內(nèi)的時空表達(dá)以及貢獻(xiàn)率。

4 結(jié)論

無論是在正常培養(yǎng)還是缺鐵脅迫條件下，小麥苗期SPAD值均存在品種間差異。正常條件下，SPAD值均值為39.18，變幅為28.33～48.19；缺鐵脅迫條件下，均值為3.56，變幅為0.07～12.87；脅迫指數(shù)均值為-90.89，變幅為-99.83～-68.06，品種間均存在極顯著差異。利用可變類平均法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，歐式距離為10時，供試小麥材料可劃分為5大類群，第5類群在2種處理下SPAD值均表現(xiàn)較高。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，在正常培養(yǎng)條件下檢測到23個顯著SNPs，分布于14對染色體，其中在3B染色體上檢測到4個顯著SNPs。

致謝：感謝賈繼增和高麗鋒研究員無償提供76份小麥試驗材料的SNPs數(shù)據(jù)。

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