李文蘭 李文才 孫琦 于彥麗 趙勐 李艷嬌 孟昭東

摘要：CCCH型鋅指蛋白是鋅指蛋白超家族的一個亞家族，一般包含1～6個由三個半胱氨酸和一個組氨酸組成的基序，在植物的生長發(fā)育和非生物脅迫過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究中，我們對CCCH型鋅指蛋白基因ZmC3H18的序列及表達進行了分析。ZmC3H18蛋白包含2個CCCH結構域，系統(tǒng)進化樹分析表明ZmC3H18與單子葉植物中同源基因的進化關系更近。ZmC3H18基因在組織器官中呈組成型表達，但是在生殖器官中的表達量高于在營養(yǎng)器官中的表達量。ZmC3H18基因在氣生根中的表達模式顯示該基因在氣生根原基起始過程中表達量最高。此外，順式作用元件分析顯示ZmC3H18基因的啟動子區(qū)含有響應冷、熱和干旱脅迫的順式作用元件。實時定量PCR分析顯示ZmC3H18基因的表達受非生物脅迫（冷、熱、鹽和干旱）調(diào)控。這些表達結果顯示ZmC3H18基因在生殖生長和非生物脅迫過程中均發(fā)揮重要作用。本試驗結果將為玉米ZmC3H18基因的功能研究提供重要信息。

關鍵詞：玉米；ZmC3H18；CCCH結構域；表達分析

中圖分類號：S513：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）08-0007-05

Sequence and Expression Analysis of ZmC3H18 Gene in Maize

Li Wenlan， Li Wencai， Sun Qi， Yu Yanli， Zhao Meng， Li Yanjiao， Meng Zhaodong

（Maize Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/National Engineering

Laboratory of Wheat and Maize/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of

Maize in Northern Yellow-Huai River Plain， Ministry of Agriculture， Jinan 250100， China）

Abstract CCCH type zinc finger proteins that one group of the super zinc finger families are shown to contain 1～6 CCCH-type zinc finger motifs characterized by three cysteines followed by one histidine. The CCCH zinc-finger proteins play important regulatory roles in many developmental processes and abiotic stress responses. In this study， we analyzed the sequence and expression of CCCH type zinc finger protein gene ZmC3H18. The ZmC3H18 gene contained two CCCH motifs， and the phylogenetic analysis showed that ZmC3H18 and three other proteins from monocotyledon were clustered into the same clades. ZmC3H18 was expressed ubiquitously in various organs， but its transcript levels were higher in reproductive organs than in vegetative organs. Moreover， the expression pattern of ZmC3H18 in brace roots indicated that ZmC3H18 expression level in brace root initiation was the highest. In addition， the promoter region of ZmC3H18 contains cis-acting element involved in cold， hot and drought. Real time quantitative PCR analysis showed that the expression pattern of ZmC3H18 was regulated by abiotic stresses （cold， hot， salt and drought）. The expression results suggested that ZmC3H18 played important roles in reproductive development and abiotic stress responses. The findings of the present study would provide important informations to help us understand the function of ZmC3H18 in maize.

Keywords Maize； ZmC3H18； CCCH domain； Expression analysis

鋅指蛋白超家族包含ERF、WRKY、DOF和RING-finger等多個亞家族[1-4]，CCCH型鋅指蛋白是其中一個亞家族。CCCH型鋅指蛋白一般包含1～6個由三個半胱氨酸和一個組氨酸組成的基序[5，6]，它通過識別并結合RNA發(fā)揮生物學功能，而其他類型的鋅指蛋白則是通過結合DNA或蛋白發(fā)揮作用[7]。CCCH型鋅指蛋白在植物的生長發(fā)育和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。例如，擬南芥中的HUA1通過識別結合RNA的方式參與花發(fā)育調(diào)控[8]，而AtSZF1和AtSZF2則參與鹽脅迫響應過程[9]。玉米中的CCCH型鋅指蛋白基因家族共有68個成員[10]，其中ZmC3H18基因在氣生根早期發(fā)育的測序結果中優(yōu)勢表達[11]。本研究對該基因的序列進行了分析，并利用實時定量PCR技術對該基因在各組織器官和非生物脅迫下的表達模式進行了檢測。這些結果將為全面了解ZmC3H18基因的生物學功能提供新的信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與生長條件

試驗所用玉米材料是B73自交系。材料在光照培養(yǎng)箱中進行長日照培養(yǎng)（16 h光照/8 h黑暗）。冷脅迫處理是將培養(yǎng)兩周的幼苗置于4℃培養(yǎng)箱中進行處理；熱脅迫處理是將培養(yǎng)兩周的幼苗置于40℃培養(yǎng)箱中進行處理；鹽脅迫處理是利用250 mmol/L的NaCl對培養(yǎng)兩周的幼苗進行處理；干旱脅迫處理是利用15%的PEG6000對培養(yǎng)兩周的幼苗進行處理。在處理0、1、3、6、12、24 h和48 h后，收集處理植株的葉片用于實時定量PCR分析。對播種后14 d（V時期）的初級根、第二片葉、整個幼苗植株，播種后25 d（V5時期）的莖稈和播種后34 d（V7時期）的幼嫩雌穗、雄穗分別取材，用于實時定量PCR分析。用于檢測氣生根中基因表達水平的材料來自V5時期四個連續(xù)的節(jié)位上。

1.2 基因序列和進化分析

利用SMART軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對ZmC3H18蛋白氨基酸序列進行分析。將ZmC3H18序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，下載其他物種的同源蛋白序列。利用DNAMAN 7.0軟件對該基因和其他物種來源的同源基因進行氨基酸序列分析，并利用最大自然法（ML）構建系統(tǒng)進化樹。

1.3 啟動子區(qū)順式作用元件分析

利用PlantCare數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），對ZmC3H18基因起始密碼子上游1 500 bp的啟動子區(qū)序列進行分析。

1.4 RNA提取和實時定量PCR分析

利用Trizol試劑盒提取各樣品的總RNA，按照試劑盒說明書完成cDNA的合成和純化。實時定量PCR分析利用Bio-Rad CFX96實時定量檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），引物序列為ZmC3H18-F：5′-GACAAGAGAAGCGAGGAACC-3′和ZmC3H18-A：5′-TGAGCGAACTGGCACTGG-3′，18S rRNA基因作為內(nèi)參基因。將脅迫處理0 h的基因表達量設為1，以此為對照，計算其他時間點的基因相對表達量。試驗數(shù)據(jù)通過SPSS 18.0軟件進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 ZmC3H18基因序列及進化分析

利用SMART軟件對ZmC3H18氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其包含2個CCCH結構域（圖1A）。對ZmC3H18和其他13個物種同源基因的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)這14個蛋白均含有2個CCCH結構域（圖1B）。這說明CCCH保守結構域在不同物種中同源性極高。

為了解ZmC3H18的進化關系，經(jīng)過多重比對，構建系統(tǒng)進化樹（圖2）。結果顯示，玉米與同屬于單子葉的高粱、粟和水稻聚在同一分支，而與其他雙子葉植物的距離較遠。

2.2 ZmC3H18基因在玉米氣生根發(fā)育過程中的表達分析

CCCH型鋅指蛋白基因家族的ZmC3H18基因在氣生根早期發(fā)育的測序結果中優(yōu)勢表達，為此，我們利用實時定量PCR方法對玉米V5時期4個不同節(jié)位上處于不同發(fā)育時期的氣生根（具體的發(fā)育形態(tài)可參考文獻[12]）進行基因表達量檢測（圖3）。結果顯示，ZmC3H18基因在氣生根起始時期表達量最高，說明ZmC3H18在氣生根原基起始過程中發(fā)揮重要作用。

2.3 ZmC3H18基因在各組織中的表達分析

為了進一步了解ZmC3H18基因的表達模式，我們利用實時定量PCR方法檢測了ZmC3H18基因在玉米不同組織（根、莖、葉、幼苗、雌穗和雄穗）中的表達水平。如圖4所示，在6種組織中均檢測到ZmC3H18基因的表達，但生殖組織（雌穗和雄穗）中的表達量明顯高于營養(yǎng)組織（根、莖、葉和幼苗）中的表達量。這說明ZmC3H18基因在玉米的生殖發(fā)育過程中發(fā)揮更重要的作用。

2.4 ZmC3H18基因的順式作用元件分析

為了更好地了解ZmC3H18基因在逆境脅迫方面的作用，我們對ZmC3H18基因1 500 bp啟動子區(qū)的順式作用元件進行了分析。如表1所示，除了轉(zhuǎn)錄和光響應相關的必需順式作用元件，共找到了8個順式作用元件，包含2個生長發(fā)育相關的（GCN4_motif和Skn-1_motif）、3個逆境脅迫相關的（HSE、MBS和LTR）和3個激素響應相關的（ABRE、TGA-element和Motif Ⅱ b）元件。

2.5 ZmC3H18基因在冷、熱、鹽和干旱脅迫條件下的表達分析

ZmC3H18基因的順式作用元件包含3個逆境脅迫相關元件。為了進一步研究ZmC3H18基因?qū)δ婢趁{迫的反應，利用實時定量PCR方法檢測了ZmC3H18基因在冷、熱、鹽及干旱脅迫下的表達變化（圖5）。在冷脅迫處理下，ZmC3H18基因的表達量迅速下降，并維持在較低水平；在熱脅迫處理下，ZmC3H18基因的表達量先下降后上升，在處理24 h時達到最高峰，之后表達量又開始下降；在鹽脅迫處理下，ZmC3H18基因的表達量在處理1 h稍有下降，之后迅速下降，并維持在較低水平；在干旱脅迫處理下，ZmC3H18基因的表達量也迅速下降。這些結果表明，ZmC3H18基因涉及多種逆境脅迫響應。

3 討論與結論

CCCH型鋅指蛋白是鋅指超蛋白家族的一個亞家族，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及生物和非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用。植物中第一個被發(fā)現(xiàn)的CCCH型鋅指蛋白基因是擬南芥中的PEI1，其參與心胚形成過程[13]。之后研究者們分別對擬南芥[14]、水稻[14]及煙草[15]等多種植物的CCCH型鋅指蛋白進行了深入研究。本研究根據(jù)氣生根早期發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[11]，獲得了一個在氣生根發(fā)育早期優(yōu)勢表達的CCCH型鋅指蛋白基因ZmC3H18，其具有兩個CCCH保守結構域，與其他植物中CCCH型鋅指蛋白結構具有較高的相似性。進化關系分析顯示ZmC3H18與單子葉植物中的CCCH型鋅指蛋白進化關系更近。

CCCH型鋅指蛋白基因參與多個生長發(fā)育過程。例如，擬南芥中的HUA1參與花發(fā)育[8]，水稻中的OsDOS參與葉片衰老調(diào)控[16]，而玉米中的ZmC3H18基因則在氣生根原基起始過程中發(fā)揮重要作用。在不同組織中的表達分析顯示，ZmC3H18基因在生殖器官中的表達量要高于營養(yǎng)器官，這暗示ZmC3H18基因在生殖階段可能發(fā)揮更重要的作用。

CCCH型鋅指蛋白基因還參與生物和非生物脅迫。例如，擬南芥中的AtSZF1和AtSZF2參與鹽脅迫響應過程[9]。而在冷、熱、干旱和鹽脅迫下，ZmC3H18基因的表達量均發(fā)生不同程度的變化，這暗示ZmC3H18基因參與多種非生物脅迫響應。本研究結果將為系統(tǒng)了解ZmC3H18基因的生物學功能提供新信息。

參 考 文 獻：

[1] Nakano T， Suzuki K， Fujimura T， et al. Genome-wide analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice [J]. Plant Physiol.， 2006， 140： 411-432.

[2] Zhang Y， Wang L. The WRKY transcription factor superfamily： its originin eukaryotes and expansion in plants [J]. BMC Evol. Biol.， 2005， 5： 1.

[3] Lijavetzky D， Carbonero P， Vicente-Carbajosa J. Genome-wide comparative phylogenetic analysis of the rice and Arabidopsis Dof gene families [J]. BMC Evol. Biol.， 2003， 3： 17.

[4] Kosarev P， Mayer K F， Hardtke C S. Evaluation and classification of RING-finger domains encoded by the Arabidopsis genome [J]. Genome Biol.， 2002， 3（4）： RESEARCH0016.

[5] Liang J， Wang J， Azfer A， et al. A novel CCCH-zinc finger protein family regulates proinflammatory activation of macrophages [J]. J. Biol. Chem.， 2008， 283： 6337-6346.

[6] Blackshear P J. Tristetraprolin and other CCCH tandem zinc-finger proteins in the regulation of mRNA turnover [J]. Biochem. Soc. Trans.， 2002， 30： 945-952.

[7] Bai C， Tolias P P. Cleavage of RNA hairpins mediated by a developmentally regulated CCCH zinc finger protein [J]. Mol. Cell Biol.， 1996， 16： 6661-6667.

[8] Li J， Jia D， Chen X. HUA1， a regulator of stamen and carpel identities in Arabidopsis， codes for a nuclear RNA binding protein [J]. Plant Cell， 2001， 13： 2269-2281.

[9] Sun J， Jiang H， Xu Y， et al. The CCCH-type zinc finger proteins AtSZF1 and AtSZF2 regulate salt stress responses in Arabidopsis [J]. Plant Cell Physiol.， 2007， 48： 1148-1158.

[10]Peng X， Zhao Y， Cao J， et al. CCCH-type zinc finger family in maize： genome-wide identification， classification and expression profiling under abscisic acid and drought treatments [J]. PLoS ONE， 2012， 7（7）： e40120.

[11]Li Y， Fu Y， Huang J ，et al. Transcript profiling during the early development of the maize brace root via Solexa sequencing [J]. FEBS Journal， 2011， 278： 156-166.

[12]Li W， Sun Q， Li W， et al. Characterization and expression analysis of a novel RING-HC gene， ZmRHCP1， involved in brace root development and abiotic stress responses in maize [J]. J. Integr. Agr.， 2017， 16（9）： 1892-1899.

[13]Li Z， Thomas T L. PEI1， an embryo-specific zinc finger protein gene required for heart-stage embryo formation in Arabidopsis [J]. Plant Cell， 1998， 10： 383-398.

[14]Wang D， Guo Y， Wu C， et al. Genome-wide analysis of CCCH zinc finger family in Arabidopsis and rice [J]. BMC Genomics， 2008， 9： 44-54.

[15]Xu R. Genome-wide analysis and identification of stress-responsive genes of the CCCH zinc finger family in Solanum lycopersicum[J]. Mol. Genet. Genomic， 2014， 289（5）： 965-979.

[16]Kong Z， Li M， Yang W， et al. A novel nuclear-localized CCCH-type zinc finger protein， OsDOS， is involved in delaying leaf senescence in rice [J]. Plant Physiol.， 2006， 141（4）： 1376-1388.