劉辰　姚玉慶　徐文玲　劉賢嫻　王淑芬

摘要：利用單因素試驗結合響應面分析法對蘿卜肉質根中蘿卜甙水解生成萊菔子素的超聲波輔助工藝條件進行了優(yōu)化。在單因素試驗的基礎上，以超聲時間、超聲功率、水浴時間、水浴溫度為影響因素，利用Box-Behnken中心組合方法進行四因素三水平的試驗設計，以提取的萊菔子素含量為響應值進行響應面分析。結果表明，最佳提取工藝為：超聲時間20 min，超聲功率240 W，水浴溫度20℃，水浴時間1.0 h，實際值與理論值相差較小，通過響應面法優(yōu)化得到的萊菔子素超聲輔助提取工藝可靠。

關鍵詞：蘿卜；萊菔子素；響應面法；超聲波輔助提取

中圖分類號：S631.109+.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）08-0152-05

Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction Technology of

Sulforaphene in Radish （Raphanus sativus L.） Root

Liu Chen， Yao Yuqing， Xu Wenling， Liu Xianxian， Wang Shufen

（Institute of Vegetables and Flowers， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of

Greenhouse Vegetable Biology/Shandong Branch of National Vegetable Improvement Center， Jinan 250100， China）

Abstract The ultrasound-assisted hydrolysis conditions of glucoraphenin to sulforaphene in radish taproot was optimized by single factor experiments and response surface methodology. On the basis of single factor experiments， a three-level-four-factor test was employed to optimize the parameters （ultrasonic power， ultrasonic time， water-bath time， water-bath temperature） by using Box-Behnken design of response surface methodology， and the content of sulforaphene was taken as the response value. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows： ultrasonic time of 20 min， ultrasonic power of 240 W， water-bath temperature of 20℃ and water-bath time of 1.0 h. Under these conditions， the yield was close to the theoretical value. So the ultrasonic-assisted extraction conditions optimized by response surface methodology were reliable.

Keywords Radish； Sulforaphene； Response surface methodology； Ultrasonic-assisted extraction technology

蘿卜（Raphanus sativus L.），又稱萊菔，十字花科蘿卜屬異花授粉、一年或者兩年生草本植物，根菜類蔬菜。蘿卜不僅營養(yǎng)豐富，更具有藥食同源的價值，在我國已有1 400多年的藥用歷史[1]。

蘿卜與其他十字花科蔬菜一樣，含有多種硫代葡萄糖苷[2]。此外，蘿卜中還富含其他十字花科蔬菜所沒有的蘿卜甙（glucoraphenin），該成分在黑芥子酶的催化下酶解產(chǎn)生萊菔子素（sulforaphene）。萊菔子素與目前研究較為深入的抗癌活性物質萊菔硫烷同屬異硫氰酸酯類物質，二者具有相同的功能基團，唯一的區(qū)別在于前者碳鏈結構上含有1個雙鍵。已有的研究表明，萊菔子素在抗氧化、抑制細胞突變、抗癌等方面起著重要作用，其抑制突變的能力甚至高于萊菔硫烷[3-6]。

相對于萊菔硫烷而言，目前關于萊菔子素的提取和檢測研究較少，提取工藝的優(yōu)化也主要集中在對萃取條件和酶解時間、溫度等條件方面的分析上[7-9]。然而，前人的研究成果表明，除這些因素外，超聲波輔助法能夠有效提高硫代葡萄糖苷水解生成異硫氰酸酯的轉化率，并且不同植物中異硫氰酸酯類物質超聲波輔助提取的最優(yōu)條件并不相同[10，11]，而在蘿卜中這方面的研究較少。因此，有必要研究超聲波輔助能否促進蘿卜肉質根中萊菔子素的生成，以及超聲波輔助的最佳工藝條件。本研究以蘿卜肉質根為試驗材料，利用超聲波輔助蘿卜甙水解生成萊菔子素，在單因素試驗的基礎上采用響應面法優(yōu)化試驗設計，篩選最佳工藝條件，以期為蘿卜中萊菔子素的規(guī)?；崛√峁┘夹g參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以紅皮白肉型蘿卜14Q82為試驗材料，2015年秋季種植于山東省農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所試驗基地，田間常規(guī)管理，收獲期采收，選取大小一致、無機械損傷、成熟度一致的肉質根，取中間部位用四分法取對角線部分，切碎后混合取樣，液氮速凍后置于超低溫冰箱保存；樣品經(jīng)冷凍干燥機冷凍干燥，研磨成粉狀，過60目篩，存于超低溫冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 萊菔子素含量測定 稱取0.2 g蘿卜樣品粉末，按固液比1∶20加入pH 為5.0的磷酸緩沖液，混合均勻后超聲浸提，在恒溫水浴中水解，然后加入45 mL的乙酸乙酯室溫萃取30 min，6 000 r/min離心3 min后取上清液，再重復萃取2次合并萃取液，35℃旋轉蒸發(fā)儀蒸干，最后用10 mL色譜甲醇復溶，過0.22 μm有機濾膜，待測。HPLC 測定條件及標準曲線制作同本課題組之前研究[12]。

1.2.2 單因素試驗設計 按照1.2.1的提取工藝進行單因素分析，分別檢測超聲時間、超聲功率（總功率600 W）、水浴溫度和水浴時間4個因素對萊菔子素含量的影響，每次設置3次重復。在單因素方差分析中，通過F檢驗來判斷單因素對萊菔子素含量的影響是否顯著。

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗設計 在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以這4個因素為自變量，設計響應面試驗。利用Design-Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行綜合分析，建立萊菔子素含量回歸模型，確定最優(yōu)的工藝條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲時間對萊菔子素含量的影響 在超聲功率30%、水浴溫度30℃、水浴時間1 h的條件下，設置不同的超聲時間，計算萊菔子素的含量。由圖1結果可以看出，超聲波輔助10 min與20 min測得的萊菔子素含量略有增加，但不是很明顯；當超聲時間達到30 min時，提取的萊菔子素含量最高，但是隨著超聲時間的增加，萊菔子素含量反而降低。因此，選取最佳超聲時間為30 min。

圖1 不同超聲時間對萊菔子素含量的影響

2.1.2 超聲功率對萊菔子素含量的影響 在超聲時間30 min、水浴溫度30℃、水浴時間1 h的條件下，設置不同的超聲功率（總功率600 W），計算萊菔子素的含量。由圖2結果可以看出，超聲功率在10%～30%范圍內，隨著超聲功率的增加，提取的萊菔子素含量顯著增加；在30%～40%范圍內，略有增加，但不顯著。超聲功率在40%～60%時，萊菔子素含量卻逐漸減少。因此，最適合萊菔子素生成的超聲功率為30%。

2.1.3 水浴溫度對萊菔子素含量的影響 在超聲時間30 min、超聲功率30%、水浴時間1 h的條件下，設置不同的水浴溫度，計算萊菔子素的含量。由圖3結果可以看出，隨著水浴溫度的增加，提取的萊菔子素含量先增加后降低。25℃時，萊菔子素含量最高，而且在20～30℃范圍內含量較高。但是較高溫度下，水解生成的萊菔子素含量則逐漸減少。由此可見，當水浴溫度25℃時，更有助于萊菔子素的生成。

2.1.4 水浴時間對萊菔子素含量的影響 在超聲時間30 min、超聲功率30%、水浴溫度30℃的條件下，設置不同的水浴時間，計算萊菔子素的含量。由圖4結果可以看出，萊菔子素含量在水浴1.0 h時出現(xiàn)最高峰，水浴0～0.5 h范圍內，萊菔子素含量略有增加，0.5～1.0 h范圍內，萊菔子素含量明顯增加，之后隨著水浴時間的增加，萊菔子素含量緩慢降低。因此，選取最佳的水浴時間為1.0 h。

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果 采用四因素三水平的響應面法對顯著影響萊菔子素含量的超聲時間、超聲功率、水浴溫度和水浴時間4個因素進行綜合分析，以確定通過水解生成萊菔子素的最優(yōu)組合工藝條件。響應面設計各因素水平見表1。根據(jù)Design-Expert 8.0軟件進行試驗設計，設計方案及結果見表2。

對所得數(shù)據(jù)進行分析，建立萊菔子素含量回歸模型，尋找最優(yōu)的反應條件。根據(jù)參數(shù)分析，對試驗數(shù)據(jù)進行多項式擬合回歸，得到二階響應表面模型方程：Y=390.26-35.56A-18.46B+15.77C-29.34D+26.31AB+1.37AC+8.88AD-1.17BC+10.28BD-11.27CD-65.11A2-39.45B2-46.62C2-142.31D2

對回歸方程進行方差分析，發(fā)現(xiàn)該模型的線性影響效果極顯著（P<0.0001），從表3中F值和公式中各因素的系數(shù)可以看出，對萊菔子素含量影響最大的是A，其次是D、B、C，即超聲時間>水浴時間>超聲功率>水浴溫度；二次項A2、B2、C2、D2影響顯著；交互項均不顯著；失擬項P>0.05，失擬不顯著，可知該數(shù)學模型對試驗的擬合程度較好。

根據(jù)回歸方程做出響應面，分析擬合響應曲面的形狀，研究超聲時間、超聲功率、水浴溫度和水浴時間4個因素對萊菔子素含量的影響。圖5顯示了各因素對萊菔子素含量的影響以及各因素之間的交互作用。響應曲面陡峭說明兩因素交互作用的影響顯著，反之，響應曲面平緩則說明兩因素交互作用的影響較小。響應曲面均為向下開口的凸面，等高線為橢圓形，中心位于所考察的區(qū)域范圍內，由此可知，在考察的范圍內存在萊菔子素含量的極大值。

2.2.2 最佳條件驗證 利用Design-Expert 8.0軟件計算萊菔子素含量的回歸方程，得到最優(yōu)工藝：超聲時間21.36 min，超聲功率37.2%，水浴溫度18.5℃，水浴時間57.8 min，萊菔子素含量預測的最大值為403.47 μg/g。為驗證響應面法的可靠性，使用優(yōu)化后的最佳工藝條件進行驗證試驗，同時考慮到實際操作中的可行性和便利性，將條件修正為：超聲時間20 min，超聲功率40%，水浴溫度20℃，水浴時間60 min。在此條件下驗證測得的萊菔子素含量為398.43 μg/g，為理論值的98.75%，與預期較為符合。因此通過響應面法優(yōu)化得到超聲波輔助蘿卜甙水解生成萊菔子素的工藝條件是可靠的，具有一定的實用價值。

3 討論與結論

萊菔子素一直被認為是蘿卜辣味的主要物質，并且具有抑菌生物活性。然而，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，除以上特點外，萊菔子素在抑制基因突變方面也有較強的作用。其主要作用方式是在突變導致的DNA損傷發(fā)生后促進DNA的修復，是一種很好的抗癌物質，具有廣闊的應用前景。但是目前對萊菔子素的開發(fā)和應用還非常有限，對其提取工藝的研究也不夠深入。

研究表明，超聲波輔助可以有效促進硫代葡萄糖苷水解生成異硫氰酸酯的反應，但是在不同植物中超聲波輔助的功率、時間等條件并不相同。尹雨芳等[10]通過設計試驗得出了超聲波輔助西蘭花種苗中硫代葡萄糖苷水解生成異硫氰酸酯的最佳水解工藝：超聲處理的時間為30 min，超聲功率70.0%（即175.0 W），恒溫水浴振蕩溫度為45℃，恒溫水浴時間2 h。陳虹霞[11]通過單因素和正交試驗因子設計，優(yōu)化了辣根硫代葡萄糖苷的水解工藝，其超聲波輔助水解的最佳功率為20 W，時間為35 min，相比水浴水解有效縮短了反應時間。本研究結合單因素試驗和響應面法，探討了超聲時間、超聲功率、水浴溫度和水浴時間4個因素對萊菔子素含量的影響，優(yōu)化確定了超聲波輔助蘿卜甙水解生成萊菔子素的最佳工藝條件為：超聲時間20 min，超聲功率40%（240 W），水浴溫度20℃，水浴時間1.0 h。雖然與其他植物中硫代葡萄糖苷的超聲波輔助水解條件不同，但超聲波輔助法確實可以促進蘿卜甙的水解，在最佳工藝條件下測得的萊菔子素含量為398.43 μg/g，僅比理論值低1.25個百分點。本研究優(yōu)化得到的工藝條件可以有效提高萊菔子素的產(chǎn)量，將為今后萊菔子素的工業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)提供技術支持。

參 考 文 獻：

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