貢慶欣 李文君 張進(jìn)

安宮牛黃丸是我國(guó)傳統(tǒng)藥物中最負(fù)盛名的急癥用藥，由牛黃、水牛角、麝香、雄黃、朱砂、冰片等11味藥材組成，其中雄黃和朱砂為毒性成分[1-2]?！吨袊?guó)藥典》2015年版一部該品種項(xiàng)下沒(méi)有規(guī)定雄黃和朱砂的含量測(cè)定，無(wú)法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效控制[1]。近年來(lái)針對(duì)安宮牛黃丸質(zhì)量的研究主要集中在其他成分的含量，對(duì)雄黃和朱砂含量的研究很少[3-6]。本實(shí)驗(yàn)參照 《中國(guó)藥典》并通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索，采用原子吸收分光光度法[7]測(cè)定了不同生產(chǎn)企業(yè) 6批安宮牛黃丸中雄黃和朱砂的主要成分砷和汞的含量，為制定該藥物中雄黃和朱砂含量限度提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 200 SeriesAA型原子吸收分光光度計(jì)及工作站（美國(guó)Agilent公司）；CEM MARS 高通量密閉微波消解儀（美國(guó)CEM公司）；汞、砷空心陰極燈（北京有色金屬研究總院），汞（Hg）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/ml，編號(hào)GBW08617，批號(hào)18031，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；砷（As）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/ml，編號(hào)GBW08611，批號(hào)17123，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；AL104電子天平；鹽酸和硝酸均為優(yōu)級(jí)純，水為超純水；安宮牛黃丸6批，均為市售成藥，來(lái)自6家藥品生產(chǎn)企業(yè)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)照品貯備溶液的制備：精密量取砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液和汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，分別加水制成每 1 ml含砷、汞各100μg 的溶液，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備：精密量取砷、汞對(duì)照品貯備溶液適量，分別加 10%混合酸[硝酸-鹽酸（4∶1）]溶液制成每 1 ml 含砷、汞 0 μg、1 μg、2 μg、5 μg、10 μg、20 μg、50 μg 的溶液，作為砷標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和汞標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

供試品溶液的制備：取本品10丸，剪碎，混勻，精密稱取0.2 g，置聚四氟乙烯微波消解罐中，加入硝酸 4 ml、鹽酸 1 ml，置微波消解儀中消解，消解條件：功率1 600 W，5 min內(nèi)由室溫升至120℃，在120℃保持5 min，在5 min內(nèi)由120℃升溫至160℃，在160℃保持5 min，然后5 min內(nèi)由160℃升溫至180℃，在180℃保持20 min，最后25 min內(nèi)由180℃降溫至30℃。消解液放冷，轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加 10%混合酸[硝酸-鹽酸（4∶1）]溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。同法制備試劑空白溶液。

測(cè)定：精密吸取砷、汞標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液、供試品溶液和試劑空白溶液，按照原子吸收分光光度法（火焰原子化器，標(biāo)準(zhǔn)曲線法）[7]，在 193.7 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定砷，在 253.7 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定汞，計(jì)算，即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 陰性干擾試驗(yàn) 按處方工藝制備不含雄黃的陰性樣品，取 6份，按2.1 實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定砷的含量，結(jié)果6份樣品均未檢出砷，說(shuō)明樣品中除雄黃外的其余藥材對(duì)砷的含量測(cè)定沒(méi)有干擾；按處方工藝制備不含朱砂的陰性樣品，取 6份，按2.1 實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定汞的含量，結(jié)果6份樣品均未檢出汞，說(shuō)明樣品中除朱砂外的其余藥材對(duì)汞的含量測(cè)定沒(méi)有干擾。陰性干擾試驗(yàn)表明該方法的專屬性良好。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密量取砷、汞對(duì)照品貯備溶液適量，加 10%混合酸[硝酸-鹽酸（4∶1）]溶液分別制成每1 ml 含 砷 0 μg、1 μg、2 μg、5 μg、10 μg、20 μg、50 μg 的溶液和每 1 ml 含汞 0 μg、1 μg、2 μg、5 μg、10 μg、20 μg、50 μg的溶液，照原子吸收分光光度法（火焰原子化器，標(biāo)準(zhǔn)曲線法）[7]，在 193.7 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定砷的吸光度，在 253.7 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定汞的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)（ Y，ml ），以濃度為橫坐標(biāo)（ X，μg /ml ），得砷的回歸方程Y = 5.302×10-3X +2.997×10-3，r = 0.999 6，汞的回歸方程Y= 3.793×10-3X +5.638×10-3，r = 0.999 7。結(jié)果表明砷和汞的濃度在0～50 μg/ml范圍內(nèi)與吸光度之間線性關(guān)系良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批號(hào)安宮牛黃丸，剪碎，混勻，取約0.2 g，精密稱定，共6份，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定砷和汞含量，結(jié)果砷的平均含量為37.87 mg/g，RSD 為1.39%，汞的平均含量為45.59 mg/g，RSD 為1.28%，表明方法的重復(fù)性性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取同一批號(hào)安宮牛黃丸，剪碎，混勻，取約0.2 g，精密稱定，共6份，分別放置0、2、4、8、12、24小時(shí)，按2.1.1項(xiàng)下方法測(cè)定硫化汞含量，結(jié)果砷的RSD 為1.32%，汞的RSD 為1.45%，表明在24小時(shí)內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知砷含量的安宮牛黃丸（批號(hào)17030006，As含量37.93mg /g）6份，每份約0.1 g，精密加入砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/ml ） 4 ml，混勻，按2.1實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定砷的回收率，結(jié)果平均回收率為 98.86%，RSD為1.08%。

精密稱取已知汞含量的安宮牛黃丸（批號(hào)17030006，As含量45.65 mg /g）6份，每份約0.1 g，精密加入汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/ml ） 4 ml，混勻，按2.1實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定汞的回收率，結(jié)果平均回收率為98.95%，RSD為0.99%。

加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

精密稱取6批不同批號(hào)的安宮牛黃丸樣品，每批隨機(jī)取3份，每份約 0.2 g，按2.1方法測(cè)定砷和汞的含量。結(jié)果見表 1、2。

表 1 安宮牛黃丸中砷的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

表 2 安宮牛黃丸中汞的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

4 討論

目前測(cè)定砷、汞含量的方法主要有容量法[8-9]、原子吸收分光光度法（AAS）[10-12]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）[12]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）[13]等。與AAS法相比，容量法存在操作繁瑣、靈敏度低、取樣量大、有時(shí)消化不完全等缺點(diǎn)；ICP-AES法和ICP-MS由于靈敏度太高，當(dāng)樣品中砷、汞含量較高時(shí)，容易導(dǎo)致儀器被污染。AAS法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，適合應(yīng)用于中成藥中雄黃和朱砂的含量測(cè)定。

由于本品中雄黃和朱砂含量較高，用石墨爐原子化器容易導(dǎo)致石墨爐被污染，用氫化物發(fā)生原子化器操作相對(duì)繁瑣，選擇火焰原子化器操作簡(jiǎn)便，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

實(shí)驗(yàn)中選擇不同的消解試劑進(jìn)行比較，即硝酸、硝酸-鹽酸（4∶1）、硝酸-鹽酸（3∶2）、硝酸-過(guò)氧化氫（4∶1），結(jié)果選擇硝酸-鹽酸（4∶1）消解效果最好。同時(shí)還對(duì)微波消解的不同升溫條件進(jìn)行了比較，結(jié)果在正文中的升溫條件下消解最完全。

采用本文方法對(duì)6批安宮牛黃丸中雄黃和朱砂的含量進(jìn)行了測(cè)定，6批供試品中的砷含量為18.27～37.93 mg/g，汞含量為22.79～43.65 mg/g。按每丸重3 g計(jì)算，砷含量在54.81～113.79 mg /丸范圍內(nèi)，汞含量在 68.37～130.95 mg /丸范圍內(nèi)。不同廠家、批次樣品含量差異較大，分析原因主要有以下幾方面：（1）有的企業(yè)對(duì)所用的雄黃和朱砂藥材未測(cè)定含量，可能采用不合格的雄黃和朱砂投料；（2）有的企業(yè)未按規(guī)定對(duì)雄黃和朱砂進(jìn)行水飛炮制，故不敢按處方規(guī)定加入足量的雄黃和朱砂；（3）由于藥典對(duì)安宮牛黃丸中的雄黃和朱砂未規(guī)定含量測(cè)定，個(gè)別企業(yè)為了降低成本，在生產(chǎn)中有意減少雄黃和朱砂黃的投料量。

雄黃和朱砂的主要成分分別為二硫化二砷（As2S2）和硫化汞（HgS），由于處方中只有雄黃含砷，朱砂含汞，可以根據(jù)測(cè)定砷和汞的含量來(lái)確定制劑中雄黃和朱砂的含量限度以及含量上限。建議《中國(guó)藥典》增加安宮牛黃丸中雄黃和朱砂的含量測(cè)定，以有效控制生產(chǎn)投料，保證藥品質(zhì)量。