陶 璇，顧以韌，楊雪梅，梁 艷，鐘志君，楊躍奎，曾 凱，陳曉暉，王 言，龔建軍，應(yīng)三成，王 衛(wèi)，呂學(xué)斌

（1. 四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610066；2. 成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610106）

miRNA是一類長度約22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生等基本生物過程中起著重要作用，是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子[1]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a和miR-27b在細(xì)胞中過表達(dá)能夠降低脂蛋白酯酶（Lipoprotein Lipase，LPL)基因的表達(dá)量，進(jìn)而抑制甘油三酯的積累以及脂肪生成基因的表達(dá)[2-3]；miR-378在脂肪組織中影響脂肪的生成，在細(xì)胞中過表達(dá)可引起脂肪代謝基因表達(dá)上調(diào)[4-6]。脂肪組織不僅是動物機(jī)體能量儲存的一種形式，還參與調(diào)節(jié)包括食欲和能量消耗等多個(gè)機(jī)體功能，且對繁殖、炎癥和免疫反應(yīng)等多個(gè)復(fù)雜的生理過程也有重要調(diào)控作用[7]。研究豬的脂肪代謝不僅有利于改善其胴體和肉質(zhì)性能，還有助于推動人類肥胖和代謝性疾病的研究。

本研究采用QRT-PCR技術(shù)檢測了7個(gè)豬種背部皮下脂肪組織中miR-27a、miR-27b和miR-378的差異表達(dá)，以期為探明不同豬種脂肪沉積能力及肉質(zhì)差異形成的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)豬均由四川省畜牧科學(xué)研究院種豬科研基地提供。7個(gè)豬種包括引進(jìn)豬種大約克夏豬和6個(gè)四川省地方豬種（丫杈豬、內(nèi)江豬、青峪豬、雅南豬、成華豬、藏豬），每個(gè)豬種隨機(jī)選取3頭30日齡健康斷奶仔豬，共21頭，同一時(shí)間開始組建群體，相同品種同欄飼養(yǎng)，采用相同的營養(yǎng)水平和飼喂方式，達(dá)到6月齡進(jìn)行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集倒數(shù)3～4肋骨間對應(yīng)處的背部皮下脂肪組織和背最長肌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表型指標(biāo)測定 瘦肉率、平均背膘厚按《豬胴體性狀測定技術(shù)規(guī)范》（NY/T 825-2004）的方法測定并計(jì)算，單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量按《肉與肉制品脂肪酸測定》（GB/T 9695.2-2008）的方法測定。

1.2.2 總RNA提取和QRT-PCR 脂肪組織的RNA按照miRNeasy Mini Kit(Qiagen， China)的操作說明書提取，QRT-PCR 采用 miScript ⅠⅠ RT Kit （Qiagen，China）根據(jù)操作說明將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用miScript SYBR?Green PCR Kit （Qiagen，China） 在 CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）儀器上進(jìn)行熒光定量檢測，每個(gè)反應(yīng)體系20 μL。5S、18S和U6作為miRNA定量的內(nèi)參基因，引物信息見表1。所有目的miRNA定量結(jié)果均通過熔解曲線分析驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性，確保產(chǎn)物無引物二聚體，每個(gè)樣本重復(fù)3次，每次檢測含3個(gè)陰性對照。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的miRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SigmaPlot 12.5軟件對性狀指標(biāo)和基因相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（ANVOA），結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 胴體及肉質(zhì)性狀測定 由表2可知，在7個(gè)豬種中，大約克夏豬瘦肉率最高，丫杈豬其次，青峪豬最低，6個(gè)地方豬種之間的瘦肉率差異不顯著（P＞0.05），但均極顯著低于大約克夏豬（P＜0.01）；大約克夏豬平均背膘厚最小，雅南豬其次，內(nèi)江豬最大，大約克夏豬平均背膘厚顯著或極顯著小于雅南豬（P＜0.05）、內(nèi)江豬和藏豬（P＜0.01），6個(gè)地方豬種中，雅南豬平均背膘厚顯著小于內(nèi)江豬、青峪豬和藏豬（P＜0.05）；單不飽和脂肪酸含量丫杈豬最高，青峪豬其次，大約克夏豬最低，顯著低于除雅南豬之外的其余5個(gè)地方豬種（P＜0.05），6個(gè)地方豬種中，丫杈豬、青峪豬的單不飽和脂肪酸含量極顯著高于雅南豬（P＜0.01）；大約克夏豬的多不飽和脂肪酸含量極顯著高于地方豬種（P＜0.01），6個(gè)地方豬種間差異不顯著（P＞0.05）。

表1 引物信息表

表2 不同豬種相關(guān)胴體及肉質(zhì)性狀測定結(jié)果

2.2 3種miRNA的表達(dá)水平 由圖1可知，大約克夏豬miR-27a相對表達(dá)量顯著高于丫杈豬、雅南豬、藏豬（P＜0.05），極顯著高于內(nèi)江豬、青峪豬、成華豬（P＜0.01）；6個(gè)地方豬種間miR-27a相對表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05），其中雅南豬最高，內(nèi)江豬最低；大約克夏豬miR-27b、miR-378相對表達(dá)量均極顯著高于6個(gè)地方豬種（P＜0.01）；地方豬種中，雅南豬miR-27b、miR-378相對表達(dá)量最高，丫杈豬miR-27b相對表達(dá)量最低，成華豬和內(nèi)江豬miR-378相對表達(dá)量最低；雅南豬miR-27b相對表達(dá)量顯著高于丫杈豬和內(nèi)江豬（P＜0.05），青峪豬、雅南豬、成華豬與藏豬這4個(gè)地方豬種間的miR-27b相對表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05），地方豬種間miR-378相對表達(dá)量差異也不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同豬種背部皮下脂肪miR-27a、miR-27b、miR-378表達(dá)水平

2.3 3種miRNA的表達(dá)水平與胴體、肉質(zhì)相關(guān)性狀的相關(guān)性 由表 3可知，miR-27a、miR-27b、miR-378在背部皮下脂肪中的表達(dá)水平與瘦肉率、多不飽和脂肪酸含量均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與平均背膘厚呈負(fù)相關(guān)（P＞0.05）；miR-27b在背部皮下脂肪中的表達(dá)水平與單不飽和脂肪酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），miR-27a、miR-378在背部皮下脂肪中的表達(dá)水平均與單不飽和脂肪酸含量呈負(fù)相關(guān)（P＞0.05）。

3 討 論

為探明豬脂肪沉積性狀相關(guān)基因或調(diào)控因子差異表達(dá)的分子遺傳機(jī)理，近年來育種學(xué)家已在豬脂肪沉積的調(diào)控機(jī)理方面做了大量研究[8-10]，但這些研究主要集中在DNA和mRNA水平的編碼基因，隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)和功能研究的深入，從轉(zhuǎn)錄后的miRNA水平探索豬脂肪沉積形成的分子機(jī)理成為研究熱點(diǎn)。胴體瘦肉率是評價(jià)胴體品質(zhì)的主要指標(biāo)，而脂肪是影響豬經(jīng)濟(jì)價(jià)值和肉質(zhì)風(fēng)味的重要因素[11-12]。本研究中6個(gè)地方豬種屬脂肪型豬種，脂肪沉積多，其胴體瘦肉率極顯著低于大約克夏豬，多不飽和脂肪酸含量顯著低于大約克夏豬，單不飽和脂肪酸含量除雅南豬外則均顯著高于大約克夏豬。這說明地方豬種肉質(zhì)優(yōu)良，口感風(fēng)味俱佳，是培育優(yōu)質(zhì)風(fēng)味豬的優(yōu)良素材。

miRNA在豬脂肪形成過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[13-14]。miR-27在脂肪細(xì)胞分化、代謝和脂肪形成中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，miR-27a和miR-27b與LPL基因的表達(dá)有關(guān)，在細(xì)胞中miR-27過表達(dá)能夠降低LPL基因的表達(dá)量，并抑制甘油三酯的積累以及脂肪生成；同時(shí)，miR-27a和miR-27b還可通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ、視黃醛X受體α、脂聯(lián)素、脂肪酸結(jié)合蛋白4和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4等脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)[14]，加速甘油三酯水解[15]。miR-378則可以增強(qiáng)脂肪酸結(jié)合蛋白4、FAS和硬脂酰輔酶A脫氫酶（SCD-1）等脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，大約克夏背部皮下脂肪中3種miRNA表達(dá)水平均顯著高于6個(gè)地方豬種；6個(gè)地方豬種背部皮下脂肪中miR-27a、miR-378相對表達(dá)量均為雅南豬最高；相關(guān)性分析顯示，3種miRNA相對表達(dá)量均與瘦肉率和多不飽和脂肪酸呈極顯著正相關(guān)。以上說明這3種miRNA可抑制豬脂肪沉積，促進(jìn)多不飽和脂肪酸生成，這與外種豬比地方豬脂肪沉積能力強(qiáng)、肉質(zhì)易酸敗的生物學(xué)特性相一致。本研究結(jié)果可為闡明豬脂肪代謝和肉品質(zhì)形成的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為優(yōu)質(zhì)風(fēng)味豬育種提供新的研究思路。

表3 miR-27a、miR-27b、miR-378與胴體、肉質(zhì)相關(guān)性狀的相關(guān)性分析