唐仁龍 ，王 羽中，汪海峰 ,

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，浙江杭州311300；2.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

近年來，畜牧養(yǎng)殖中抗生素殘留與耐藥性問題形勢嚴峻，抗生素替代物的研發(fā)是當(dāng)前熱點，飼用益生菌為替代抗生素的一種有效手段。益生菌定義為具有活性的微生物，只有在攝入活菌數(shù)達到一定數(shù)量時，才能給寄主帶來多元的益生效果[1]。農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《飼料添加劑目錄（2013）》可應(yīng)用于養(yǎng)殖動物的飼用微生物有30余種，包括各類芽孢桿菌屬、雙歧桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬等[2]。 隨著對益生菌研究的深入，越來越多的益生菌功效已經(jīng)被人們所探知，益生菌在促進人或動物健康[3]與疾病治療[4]方面都被證實了具有一定的益生效果，因此，在食品行業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中益生菌應(yīng)用也成為了熱點。

微囊化技術(shù)是利用一些可以成膜的物質(zhì)，將芯材（固體、液體和氣體）包埋在微小封閉的微膠囊內(nèi)的技術(shù)，微膠囊能保護芯材不受環(huán)境中各種嚴酷因子的壓迫[5]，增加芯材的保存時間，必要時對芯材進行可控的釋放。目前，微囊化技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)、畜牧、食品、印染等各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。為了更好地將益生菌應(yīng)用到各個領(lǐng)域，需要在生產(chǎn)和應(yīng)用過程中對益生菌進行充分的保護。本文綜述了不同微囊化材料和微囊化技術(shù)、微囊化包被改進益生菌對各種不利環(huán)境的抗逆性作用，為提高飼用益生菌的抗逆性提供一定借鑒和啟示。

1 益生菌抗逆特性及其改進技術(shù)

飼用益生菌在保存及使用時，往往會受到來自外界環(huán)境與動物體內(nèi)各種不利條件的影響，包括氧氣、高溫、胃酸、膽汁鹽、抗生素和其他細菌等，大多數(shù)益生菌對這些不利因素的抗逆性較差，導(dǎo)致自身活性降低甚至死亡。氧氣是影響益生菌儲存能力的一大關(guān)鍵因素，特別是厭氧型益生菌，這類益生菌在有氧條件下生長緩慢并死亡[6]。以口服形式進入活體腸道內(nèi)的益生菌必須經(jīng)過胃腸環(huán)境，胃酸、膽汁、胃蛋白酶等導(dǎo)致許多益生菌不能活著到達小腸后端[7]，多種乳酸菌在模擬胃液的處理過程中存活能力不斷降低，存活率不足幾萬甚至幾億分之一[8]。

為了提高益生菌在不利環(huán)境中的存活能力，對其進行保護等技術(shù)改進：①微囊化法，包裹或固定益生菌，起到保護作用；②抗性誘導(dǎo)法[9]，通過條件刺激產(chǎn)生抗性菌株；③添加保護劑[10]，在益生菌中添加保護劑提高其抗逆性。

2 益生菌微囊化的壁材

針對不同益生菌的性狀選擇合適的壁材至關(guān)重要。目前，大多數(shù)益生菌選擇的微囊化壁材主要是蛋白質(zhì)、多糖類或淀粉類物質(zhì)，不同類型的微膠囊材料的理化性質(zhì)不同，制作的微膠囊的性質(zhì)也有所區(qū)別。

2.1 蛋白類 蛋白質(zhì)由于其營養(yǎng)價值和良好的乳化性能而常被作為微囊化壁材，常用的蛋白質(zhì)壁材有乳清蛋白、酪蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、明膠等。在益生菌微囊化的應(yīng)用中，蛋白制作的益生菌微膠囊具有良好的穩(wěn)定性，能夠極好地控制益生菌在腸道內(nèi)的釋放[11]。乳清蛋白溶性極佳，乳化性優(yōu)良，但是熱敏感性強；酪蛋白表面活性較高，對低pH環(huán)境具有較強的緩沖能力。已有一些技術(shù)通過乳清蛋白和酪蛋白來包囊?guī)追N乳酸菌和雙歧桿菌，提高它們的抗逆性[12]。明膠具有良好的水溶性、乳化性和降解性[13]，經(jīng)常與海藻酸鈉相結(jié)合用于益生菌的包被[14-15]。

2.2 多糖類 益生菌微囊化的多糖類壁材的種類很多，可分為碳水化合物類、植物膠類和細菌多糖類等，由于大多數(shù)多糖具有良好的生物相容性、合適的粘稠度與一定的溶解性，并能在生物中降解，所以許多研究者選擇用多糖作為主要的微囊化材料。常見的多糖類微囊化壁材及其特點見表1。

2.3 改性淀粉 近年來，以淀粉為基質(zhì)的微囊化產(chǎn)品在食品行業(yè)中日益增加。淀粉具有安全無毒、材料成本低、不致敏且味道平淡的特點。淀粉常常通過物理法、化學(xué)法和酶改法變成改性淀粉，以達到微囊化材料所需的性質(zhì)[16]。微孔淀粉吸附能力強，增加微孔淀粉濃度可以提高細胞的存活率，微孔淀粉在模擬胃腸道內(nèi)能保護益生菌[17]。Cortés等[18]提出，改性過的莧菜淀粉和玉米淀粉都能提高儲存期益生菌的存活能力，其中琥珀酰化淀粉使益生菌對模擬胃腸道環(huán)境產(chǎn)生更強的抗逆性。雙歧桿菌和乳酸桿菌也都能以辛烯基琥珀酸酐改性淀粉（OSA淀粉）作材料通過噴霧干燥法制成微膠囊。與海藻酸鈉作為壁材相比，聚丙烯酸鈉改性海藻酸鈉顯著提高了微膠囊中乳酸菌的抗逆性[19]。

2.4 納米材料 “納米技術(shù)”在近20年得到廣泛應(yīng)用，納米材料的大小通常在1～100 nm[20]。材料微型化導(dǎo)致了納米顆粒的比表面積顯著增加，提高其整體性能。納米材料聚合物非常適合應(yīng)用于食物的儲存，因其微小的結(jié)構(gòu)降低了氣體的滲透能力，將納米顆粒涂層在食品外能避免氧氣與其他物質(zhì)的侵蝕[21]。一種納米顆粒涂層益生菌微膠囊的技術(shù)已獲得專利，經(jīng)過蛋白質(zhì)、多糖與納米顆粒的3層包被，使得益生菌具有優(yōu)良的耐熱性、耐酸性和耐膽汁性[22]。Alireza等[23]使用生物納米復(fù)合材料對芽孢桿菌微囊化，發(fā)現(xiàn)果膠、納米甲殼素和納米木質(zhì)纖維素以2:1:1復(fù)合使用對胃腸道環(huán)境具有良好的抗逆作用，這是由于納米纖維的非水溶性抵抗了微膠囊在胃腸道內(nèi)的消化降解。

3 益生菌微囊化包被的方法

益生菌常用擠壓法、乳化法、噴霧干燥法等微囊化技術(shù)進行包囊[24]，在此基礎(chǔ)上選用合適的包囊材料進行封裝，提高益生菌的包埋率以及對不利因素的耐受能力。

3.1 擠壓法 擠壓法是一種很早就存在的微囊化技術(shù)[25]，是將芯材與壁材混合的過程，并通過一系列?？?，用壓力將混合懸浮溶液擠入凝固液中，當(dāng)混合物接觸凝固液時，壁材析出將芯材包裹并發(fā)生硬化的過程。擠壓法加工過程條件溫和，操作簡單，但微膠囊粒徑較大。Chen等[26]將乳酸菌與黃原膠混合，逐滴滴入殼聚糖溶液形成微膠囊，通過單因素試驗提高了包埋率，進一步優(yōu)化了嗜酸性乳酸菌微膠囊的制作。Arain[27]在使用擠壓法包埋乳酸片球菌的過程中發(fā)現(xiàn)微膠囊的結(jié)構(gòu)隨著殼聚糖pH與黃原膠濃度的改變發(fā)生變化。Seth等[28]在擠壓法的基礎(chǔ)上加入噴霧手段，使微囊化后嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌的存活率分別達到24.8%與72.6%。

表1 常用益生菌微囊化的多糖類壁材[11]

3.2 噴霧干燥法 噴霧干燥法是將液體通過噴霧干燥器噴成霧滴形態(tài)，并且依靠干燥介質(zhì)與霧滴的均勻混合，進行熱交換和質(zhì)交換，最后使溶劑氣化或溶解物固化形成微膠囊。噴霧干燥法具有干燥速度快、產(chǎn)品純度高、生產(chǎn)簡單利于連續(xù)化生產(chǎn)等優(yōu)點，但由于干燥溫度較高，較適用于熱敏性物質(zhì)[29]。Ying等[30]使用氫化棕櫚仁硬脂、水解乳清蛋白和糊精化的木薯淀粉作為微囊化壁材，與凍干的鼠李糖乳桿菌（LGG）混合通過噴霧干燥機制成LGG微膠囊，并考察了壁材中加入抗氧化劑抗壞血酸鈉和生育酚對微膠囊中LGG存活能力的影響，結(jié)果表明抗壞血酸鈉對微膠囊中LGG的存活有不利影響，生育酚則有利于LGG的存活。Mahsa等[31]采用噴霧干燥法將LGG與壁材乳清蛋白（WPⅠ）、菊粉（ⅠN）、波斯膠（PG）混合，調(diào)整噴霧干燥機進口溫度100 、出口溫度60 制作微膠囊，該微膠囊在模擬胃液、腸液作用下以及儲存過程中都提高了乳酸菌的存活率，且粒徑分布均勻。Yao等[32-33]通過噴霧干燥法成功制作了戊糖片球菌和乳酸桿菌微膠囊，使益生菌長期儲存，降低了益生菌在胃傳遞過程中的損失，同時發(fā)現(xiàn)微膠囊中加入MgO對益生菌的儲存、耐熱與耐酸等各方面都具有提高作用。

3.3 冷凍干燥法 冷凍干燥法是一種傳統(tǒng)的保存細菌的方法。益生菌與壁材混合后在-90～-40 被冷凍，然后在低壓較高溫下直接升華，最后得到多孔微膠囊[34]。因為在冷凍干燥時容易對細胞造成傷害，所以往往需要加入各種低溫保護劑[35]。Mahsa等[31]在-80 冷凝，0.02 mbar真空壓下將LGG與壁材（乳清蛋白、菊粉、波斯膠）混合液在單室冷凍干燥機中冷凍干燥24 h以上制得微膠囊，該凍干微膠囊有利于乳酸菌在消化系統(tǒng)環(huán)境中存活。冷凍干燥法并不是一種溫和的微囊化技術(shù)，現(xiàn)在更多研究者往往將這種方法與其他微囊化技術(shù)結(jié)合以充分發(fā)揮其干燥功能。如將嗜熱鏈球菌的殼聚糖/海藻酸鈉微膠囊冷凍干燥后，其微膠囊在以海藻糖和脫脂牛奶作為凍干保護劑時，凍干存活率可高達82.54%[36]。Shoji等[37]對嗜酸性乳酸菌先采用復(fù)凝聚法后采用冷凍干燥法制備了微膠囊，提高了乳酸菌各方面的耐受能力，同時微囊化乳酸菌在長達120 d 的冷藏條件下活菌數(shù)依然高于107CFU/g。

3.4 乳化法 乳化法是將細胞與載體混合，形成油包水或水包油的均勻乳液體系，加入穩(wěn)定劑后，在液滴表面形成保護層，得到微膠囊[38]。與擠壓法一樣，乳化法也不需要復(fù)雜的設(shè)備，更易于工業(yè)化生產(chǎn)，微膠囊粒徑較小。乳化法制備海藻酸鈉微膠囊又可分為內(nèi)源乳化法和外源乳化法[39-40]。陽暉[41]在制備腸溶性嗜酸乳桿菌的過程中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源乳化法制備的微膠囊包埋率更高，可達72.5%。趙萌等[42]采用內(nèi)源乳化法制備嗜酸乳桿菌微膠囊，發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉與魔芋葡甘糖作為壁材提高了微膠囊對乳酸菌的保護作用，且保護效果與魔芋葡甘糖的分子量大小有關(guān)。Zhang等[43]在噴霧干燥微粒的基礎(chǔ)上采用乳化的方法將唾液乳桿菌進行了多層微囊化，認為S/O/W乳化系統(tǒng)可以對益生菌起到良好的保護作用。

3.5 復(fù)凝聚法 凝聚法是將芯材穩(wěn)定地乳化分散在壁材溶液中，通過加入某一物質(zhì)或調(diào)節(jié)溶液pH和溫度，或采取某些特殊方法，降低壁材的溶解度，使壁材析出凝聚包裹在芯材周圍，形成微膠囊。復(fù)凝聚法則是2種壁材由于相反電荷的相互作用使溶解度降低形成微膠囊的過程。該方法的操作過程較為溫和，微膠囊產(chǎn)品制作速度快[44]。賀紅軍等[45]以明膠和阿拉伯膠作為壁材，采用復(fù)凝聚法對嗜酸乳桿菌進行微囊化，找到了微膠囊制備的最佳工藝條件，提高了嗜酸乳桿菌的儲藏穩(wěn)定性、包埋率、耐酸性等方面抗逆性。Ribeiro等[46]提出與其他微膠囊技術(shù)相比，復(fù)凝聚法制作的微膠囊對益生菌的保護效果更佳。選用乳清蛋白/果膠對嗜酸性乳酸菌進行復(fù)凝膠微膠囊制備，證明了復(fù)凝聚微囊化對乳酸菌起到了保護作用[47]。將復(fù)凝聚法同其他干燥方法結(jié)合可以提高益生菌氧化穩(wěn)定性和存活能力[48]。

4 微膠囊化對益生菌抗逆特性的作用效果

4.1 耐酸性能 一般來說，抵抗胃酸保護益生菌安全地進入腸道是所有微膠囊都需具備的能力[49]。Mahsa等[31]選用3種微囊化干燥技術(shù)（電子噴霧、冷凍干燥、噴霧干燥）對LGG進行包被，結(jié)果顯示3種干燥方法對乳酸菌微膠囊的耐酸能力差異顯著，其中冷凍干燥和噴霧干燥的微膠囊對乳酸菌更具保護作用。Yao等[33]認為，在微膠囊中加入MgO提高了微膠囊的耐酸性可能是由于MgO中和了酸性環(huán)境中的H+，從而減輕了細胞承受的酸性壓力。Gebara等[47]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)凝聚法制備的微膠囊壁材乳清蛋白/果膠并沒有在胃酸環(huán)境中對嗜酸性乳酸菌起到額外的保護作用，而Gerez等[50]提出乳清蛋白/果膠的雙層微膠囊在胃酸環(huán)境中提高了乳酸菌的存活能力。當(dāng)將保加利亞乳桿菌微膠囊與菌液同時凍干后，經(jīng)模擬胃液處理2 h后，檢測到凍干微膠囊與凍干粉活菌數(shù)分別為 1.24×109、4.3×104CFU/g[51]。大多數(shù)的微膠囊能增強益生菌的耐酸能力，這對口服的益生菌產(chǎn)品意義重大。

4.2 耐高溫性能 眾所周知，高溫會對大多數(shù)的益生菌造成傷害，甚至直接導(dǎo)致益生菌死亡。在各種食品和飲料加工過程中，巴氏消毒法作為一種重要的消毒手段，雖然加熱溫度只到達60～82 ，但對許多益生菌來說仍是致命的。Yao等[32]將微膠囊進行15 min和30 min的63 加熱處理后，使用共聚焦顯微鏡觀察乳酸菌的活菌數(shù)，結(jié)果證實微囊化確實顯著提高了乳酸菌的熱穩(wěn)定性，而含海藻酸鈉/明膠的微膠囊較單獨的海藻酸鈉微膠囊對乳酸菌的保護更佳。張琳等[52]使用乳化法制作的糞腸球菌微膠囊能在110、130 高溫下存活，耐熱性能較菌粉顯著提高。周奕先等[51]進行高溫試驗確定凍干過程可以提高菌體的耐高溫能力，且微膠囊凍干后的效果優(yōu)于凍干粉。通過擠壓技術(shù)，選用淀粉、海藻酸鈉與殼聚糖對乳酸菌和雙歧桿菌微囊化，在熱處理試驗中發(fā)現(xiàn)在55 和60 條件下的微膠囊保護效果顯著優(yōu)于游離乳酸菌，而在65 加熱30 min后，微膠囊只對封裝的雙歧桿菌具有保護作用[53]，說明同樣的微囊化處理對不同益生菌作用不同，這需要研究者根據(jù)需求與益生菌的個體差異性，對不同益生菌進行特定的微囊化處理。

4.3 耐濕性能 環(huán)境中的相對濕度可能是影響益生菌微膠囊理化性質(zhì)的一大因素。在恒定溫度下，Ying等[30]制作的微膠囊中LGG的存活能力隨著相對濕度的升高而降低，25 條件下在相對濕度分別為32%、57%、70%環(huán)境下壁材中加入生育酚對微囊的耐濕性能有所提高。以脫脂乳/蟲膠/脂質(zhì)為壁材的3殼層包囊LGG微膠囊在25 、70%相對濕度條件下儲存56 d，檢測到微囊內(nèi)LGG菌數(shù)為4.3 log10CFU/g，比單層脫脂乳包囊的LGG微膠囊提高了1.3個log值[54]。張玉華等[55]制備雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌二聯(lián)活菌微膠囊，在相對濕度60%～65%下保存3個月后，加有保護劑的微膠囊內(nèi)活菌存活率為13.28%，而無保護劑的微膠囊內(nèi)活菌存活率僅為0.38%。

4.4 儲存性能 功能性食品需要益生菌在長時間的保存期內(nèi)仍然具有活性效益，在微囊化過程中會發(fā)生細胞損傷和蛋白質(zhì)失活，但在儲存過程中的脫水、氧化同樣會對微膠囊中的益生菌產(chǎn)生傷害，從而影響益生菌的儲存性能[37]。乳酸菌在儲存期間的大量死亡主要是由于膜脂質(zhì)的氧化，所以儲存過程中的溫度和濕度是影響乳酸菌儲存性能的重要因素[56]。Ying 等[30]的噴霧干燥微膠囊在保存過程中（4 和25 ；32%、57%和70%相對濕度），所有壁材配比制得的微膠囊在4 和32%相對濕度條件下儲存性能最佳。Shoji等[40]通過復(fù)凝聚法制得微膠囊，再進行冷凍干燥，分別在7 和37 下儲存，結(jié)果顯示在最初含有9.70 log10CFU/g乳酸菌的微膠囊中，7 條件下存儲120 d活菌數(shù)仍有7.23 log10CFU/g；而在37 條件下，隨著儲存時間的增加，活菌數(shù)顯著降低，30 d時只有6.47 log10CFU/g。與大多數(shù)研究的數(shù)據(jù)一致，低溫更利于益生菌微膠囊的儲存。除了儲存條件，微膠囊的制作方法與壁材的選擇配比同樣影響著微膠囊的儲存性能。Mahsa等[31]試驗得出冷凍干燥能提高乳酸菌的儲存穩(wěn)定性。Yao等[33]通過SEM圖像觀察到，MgO可能是通過填充微膠囊內(nèi)的孔隙來抑制氧離子和氫離子進入微膠囊，從而延長益生菌的儲存時間。朱守創(chuàng)[54]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖能保護LGG細胞膜，從而提高了LGG的儲存性能。

4.5 其他因子 除了以上幾種環(huán)境壓力，如膽汁、酶以及其他物質(zhì)都有可能對微膠囊中的益生菌造成損害。Mahsa等[31]將制備的乳酸菌微膠囊分別置于4%NaCl、2%NaCl、膽汁、青霉素G和溶菌酶中，結(jié)果顯示冷凍干燥與噴霧干燥法制得微膠囊中乳酸菌的死亡率相對較低，電子噴霧微膠囊中乳酸菌死亡率最高；同時，壁材中加入波斯膠對乳酸菌抵抗這些不利因子具有顯著性效果。楊柳等[57]制作了免疫乳與雙歧桿菌復(fù)合微膠囊，發(fā)現(xiàn)膽汁鹽濃度越高對微膠囊中的雙歧桿菌傷害越大，但是復(fù)合微囊化確實能保護雙歧桿菌，在高濃度膽汁鹽處理3 h后，活菌數(shù)可達到67.7%。

5 國內(nèi)飼用益生菌微囊化的應(yīng)用

目前，微囊化技術(shù)在各領(lǐng)域都已成為重點，其在飼料工業(yè)領(lǐng)域雖被看好，但仍處于起步階段，微囊化給益生菌帶來了極大的保護作用，這必然引起飼料領(lǐng)域研究者的興趣。張慧等[58]在育肥豬的基礎(chǔ)日糧中添加微膠囊益生菌，發(fā)現(xiàn)0.5 kg/t的益生菌顯著提高了育肥豬的日增重，降低了耗料增重比，同時增加了豬腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)，減少了大腸桿菌數(shù)。為了克服植物乳桿菌與泰山松花粉多糖（TPPPS）受胃酸與酶的壓力，馬寧等[59]通過制備微膠囊再飼喂老鼠，制得的微膠囊包埋率達到了81.6%，并且飼喂微膠囊能提高老鼠小腸中的乳酸菌數(shù)量，減少大腸桿菌數(shù)，促進老鼠體重增加。張琳[38]采用乳化法制備的布拉迪酵母菌和糞腸球菌微膠囊，都顯著改善了肉雞的生產(chǎn)性能、免疫功能與腸道黏膜形態(tài)，也能很好地緩解小鼠的急性潰瘍性結(jié)膜炎。

6 展 望

微囊化技術(shù)由于能提高益生菌多方面的耐受性能，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各行業(yè)，但技術(shù)尚不成熟。首先，微囊化選擇的材料比較局限，種類較少，同樣的微囊化技術(shù)不能對所有的益生菌達到一致的保護效果；其次，微囊化方法有待進一步提高，與原先單一的微囊化方法不同，現(xiàn)在越來越多的研究者會選擇多種微囊化方法結(jié)合使用，最大化提高微囊化質(zhì)量。目前，我國的畜牧養(yǎng)殖依然存在著布局不合理、環(huán)境不舒適等問題，益生菌添加劑在使用和儲存環(huán)境中也將受到各種影響，需要為飼用益生菌提供更多的保護。

在微囊化領(lǐng)域內(nèi)，將納米技術(shù)與微囊化技術(shù)相結(jié)合已成為一大熱門，納米微粒的使用可大大提高其對益生菌的保護作用，發(fā)揮更大益生效果。如何引入更多的納米材料，使用更高效的納米封裝技術(shù)并應(yīng)用于益生菌中還需要研究者更多努力。另一方面，每一種益生菌都有其獨特的性質(zhì)，在微囊化過程中，不同的操作方法、不同的參數(shù)條件都可能影響微膠囊對益生菌的保護效益。因此，每一種微囊化技術(shù)都需要不斷進行深入研究，針對不同種類益生菌構(gòu)建相應(yīng)適宜的微囊化包被方法，創(chuàng)新微囊化技術(shù)運用于益生菌產(chǎn)品生產(chǎn)。