李婷婷，李 楨，杜 淼，邢亞楠，董煥聲，潘慶杰

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 2661091）

綿羊是第1個被馴化的放牧動物，可以給人們提供肉、皮、奶、毛等主要生產(chǎn)和生活材料，發(fā)展綿羊產(chǎn)業(yè)能夠有效提高畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益[1]。除少部分綿羊品種常年發(fā)情外，大多數(shù)品種為季節(jié)性發(fā)情，不能全年進(jìn)行配種，這在一定程度上影響了羊的繁殖效率，因此提升綿羊單產(chǎn)能力對生產(chǎn)效率有至關(guān)重要的影響[2]。由于綿羊高繁殖力的遺傳力較低，致使其育種進(jìn)程非常緩慢[3-4]。湖羊是我國選育出的高繁殖力綿羊品種之一。湖羊源于北方的蒙古羊[5-6]，具有性成熟早、繁殖率高、繁殖周期短、早期生長快等優(yōu)點(diǎn)，母羊的平均產(chǎn)羔率可達(dá)到256%，有的甚至可達(dá)300%以上，是世界上較稀少的具有高繁殖力的綿羊品種之一。相比湖羊而言，杜泊羊的繁殖力比較低，但杜泊羊胴體肉質(zhì)好，生長發(fā)育速度較快，體重在100日齡時可以達(dá)到30～35 kg。在繁殖力方面，初產(chǎn)的杜泊母羊和經(jīng)產(chǎn)的杜泊母羊繁殖率分別為135.13%和144.44%[7]。研究表明，ADPN（脂聯(lián)素）基因及PTGS2（前列腺內(nèi)過氧化物合酶2）基因是影響繁殖性狀的2個主要候選基因[8-9]。本實(shí)驗(yàn)以湖羊和杜泊羊?yàn)檠芯繉ο?，采用直接測序法對ADPN基因和PTGS2基因進(jìn)行多態(tài)性檢測，深入分析基因突變與繁殖力的關(guān)系，為進(jìn)一步完善基因選育在綿羊生產(chǎn)中的應(yīng)用、提高羊繁殖能力提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及采樣方法 實(shí)驗(yàn)選擇有1～3胎的產(chǎn)羔記錄、身體健康的65只湖羊和60只杜泊羊，在山東省朝陽畜牧有限公司同一飼喂條件下自由采食和飲水。在每只羊的耳緣部用75%酒精棉球消毒后，用耳標(biāo)鉗取耳組織1～2 cm，置于盛有無水乙醇的1.5 mL的離心管中，并在每個離心管上標(biāo)上耳號，放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 保存。

1.2 主要耗材、試劑 細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒由天根生化科技（北京）有限公司提供；DNA Marker、6×Loading Buffer、Premix Taq均購自 TaKaRa公司；核酸染料購自上海生工生物工程公司；無水乙醇，50×TAE緩沖液，瓊脂糖。

1.3 基因組DNA的提取 采用細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行湖羊和杜泊羊的耳組織基因組DNA的提取。

1.4 基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳 利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的純度，核酸分析儀測定DNA濃度，DNA OD260/OD280均在1.7～1.9。

1.5 引物設(shè)計及PCR擴(kuò)增與檢測 以牛ADPN基因序列為參照[10]，使用Primmer5.0設(shè)計ADPN基因引物，擴(kuò)增ADPN基因第3外顯子部分序列；根據(jù)Gladney等[11]提供的牛第3外顯子到第5外顯子的引物作為羊的PTGS2基因引物。引物均由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1。

1.6 PCR擴(kuò)增體系的建立 PCR擴(kuò)增體系25 μL：上、下游引物各 1 μL；DNA 模板 1 μL；Premix Taq酶 12.5 μL；超純水 9.5 μL。ADPN基因引物的最佳PCR反應(yīng)程序：95 預(yù)變性3 min，95 變性30 s，55 退火30 s，72 延伸1 min，35個循環(huán)，72 延伸10 min，4 保存。PTGS2基因引物的最佳PCR反應(yīng)程序：95 預(yù)變性3 min，95 變性30 s，53 退火30 s，72 延伸1 min，35個循環(huán)，72 延伸10 min，4保存。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 PCR產(chǎn)物的切膠回收 使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收純化，DNA溶液直接送去測序。

對ADPN、PTGS2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增切膠直接測序，對測得的序列用Megalign軟件進(jìn)行序列比對，并用Blast軟件與NCBⅠ上的原始序列進(jìn)行比對。

1.8 統(tǒng)計分析 運(yùn)用Excel 2010 軟件統(tǒng)計各綿羊ADPN、PTGS2基因位點(diǎn)的突變數(shù)、基因型及產(chǎn)羔數(shù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用SPSS 22.0 軟件中一般線性模型完成湖羊、杜泊羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果 從圖1中可以看到，條帶清晰，亮度較高，無拖尾現(xiàn)象，說明基因組DNA純度比較好，提取過程沒有蛋白質(zhì)污染，沒有DNA降解，所提取的DNA符合后續(xù)的PCR擴(kuò)增要求。

圖1 湖羊和杜泊羊DNA檢測結(jié)果

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 如圖2顯示，湖羊和杜泊羊ADPN基因引物和PTGS2基因引物PCR產(chǎn)物的目的條帶明亮并且整齊一致，擴(kuò)增片段的大小正確，特異性較好，可以用來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ADPN、PTGS2基因的目的片段分別是659、1 600 bp。

2.3 基因純化 除去PCR產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)及其他有機(jī)化合物、無機(jī)鹽離子、寡核苷酸引物等雜質(zhì)，提純后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以用來直接測序（圖3）。

2.4 突變位點(diǎn)的檢測

2.4.1ADPN基因堿基突變的檢測 如圖4～7所示（為保證突變清洗，截取部分序列長度），ADPN基因在133 bp處發(fā)生G→A的突變，該位點(diǎn)的密碼子由GAT轉(zhuǎn)變成AAT，并使編碼的氨基酸由D（天冬氨酸）轉(zhuǎn)變成N（天冬酰胺）；在594 bp處也發(fā)生G→A的突變，該位點(diǎn)的密碼子由AGA轉(zhuǎn)變?yōu)锳AA，編碼的氨基酸由R（精氨酸）轉(zhuǎn)變?yōu)镵（賴氨酸）。

表1 引物序列

圖2 ADPN、PTGS2基因PCR檢測結(jié)果

圖3 ADPN 、PTGS2基因純化結(jié)果

圖4 ADPN基因在133 bp處的堿基突變

圖5 ADPN基因133bp處的峰圖

圖6 ADPN基因在594 bp處的堿基突變

圖7 ADPN基因594 bp處的峰圖

2.4.2PTGS2基因堿基突變的檢測 如圖8、9所示，PTGS2基因在77 bp處發(fā)生遺傳變異，該位點(diǎn)的密碼子由AAA轉(zhuǎn)變?yōu)镃AA，并使編碼的氨基酸由K（賴氨酸）轉(zhuǎn)變?yōu)镼（谷氨酰胺）。

圖8 PTGS2基因在77 bp的堿基突變

圖9 PTGS2基因77 bp處的峰圖

2.5 基因突變對產(chǎn)羔數(shù)的影響 湖羊1年產(chǎn)羔羊2次或者2年產(chǎn)羔羊3次，母羊平均的產(chǎn)羔率可達(dá)256%；與湖羊相比，杜泊羊的平均產(chǎn)羔率為140%。如表2顯示，湖羊ADPN、PTGS2基因突變數(shù)均極顯著高于杜泊羊（P＜0.01）；湖羊平均產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于杜泊羊（P＜0.01）。

表2 基因突變對產(chǎn)羔數(shù)的影響

2.6 相關(guān)性分析 由表3可以看出，ADPN基因和PTGS2基因的突變與產(chǎn)羔數(shù)呈現(xiàn)極顯著相關(guān)（P＜0.01），說明相關(guān)系數(shù)的值不是偶然因素造成的；而ADPN基因和PTGS2基因Pearson相關(guān)系數(shù)值都大于0，說明這2個基因的突變與產(chǎn)羔數(shù)之間存在高度的線性正相關(guān)。

表3 ADPN、PTGS2基因與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性（n=125）

3 討 論

ADPN基因在生殖過程中通過不同水平表達(dá)來調(diào)控下丘腦和垂體、卵巢或者直接作用卵母細(xì)胞和胚胎以及雄性睪丸等。劉重旭等[12]在研究中國西南9個山羊品種發(fā)現(xiàn)，3′UTR區(qū)發(fā)生G→A突變，在不同的山羊品種中等位基因的頻率不相同。本研究在ADPN基因外顯子3共檢測到2個突變。楊彥杰等[13]對于牛的研究顯示，ADPN基因外顯子上檢測到1個突變位點(diǎn)，由于牛、羊在生物分類學(xué)上歸入偶蹄目?？?，均為反芻類食草動物，由此說明牛和羊在進(jìn)化進(jìn)程中雖然共祖，但又產(chǎn)生了基因遺傳的差異性。本研究在內(nèi)含子上沒有發(fā)現(xiàn)堿基突變，這與曹海洋[10]在小尾寒羊上檢測到內(nèi)含子中4個突變不相符，可能是綿羊品種間存在個體差異性。

Liu等[14]和Sirois[15]研究發(fā)現(xiàn)，PTGS2的表達(dá)調(diào)控決定著反芻類食草動物排卵進(jìn)程的長短。研究發(fā)現(xiàn)，PTGS2基因缺陷型的小鼠卵泡正常發(fā)育，但因黃體缺乏而導(dǎo)致不能正常排卵[16]。Linville等[17]發(fā)現(xiàn)，將野生型胚泡植入到PTGS2缺陷型小鼠子宮內(nèi)，往往不能發(fā)育，進(jìn)一步證實(shí)了PTGS2基因?qū)ν懩さ闹匾?。本?shí)驗(yàn)在湖羊的堿基序列上檢測到1處突變位點(diǎn)，這與梁瑞圓等[18]發(fā)現(xiàn)小尾寒羊上PTGS2基因擴(kuò)增片段中均存在堿基突變的結(jié)果一致。

與杜泊羊相比，湖羊高繁殖力的特征較為顯著。在本研究中，高繁殖力的湖羊群體在ADPN基因和PTGS2基因都有突變位點(diǎn)，而在杜泊羊群體中沒有發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。湖羊在ADPN基因133 bp處發(fā)生G→A突變，并使編碼的氨基酸由D（天冬氨酸）轉(zhuǎn)變成N（天冬酰胺）；在594 bp處也發(fā)生了G→A突變，編碼的氨基酸由R（精氨酸）轉(zhuǎn)變?yōu)镵（賴氨酸）。在PTGS2基因77 bp處發(fā)生了A→C突變，并使編碼的氨基酸由K（賴氨酸）轉(zhuǎn)變?yōu)镼（谷氨酰胺）。同時，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，基因的突變率與產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)，研究結(jié)果證明ADPN基因與PTGS2基因參與調(diào)控綿羊的繁殖效率。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，ADPN基因與PTGS2基因突變與產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)2個基因是影響湖羊高繁殖力的基因，可以作為高繁多胎性狀的候選基因。