陳楚珺 王靜平 魏寧頤 周梓鑫 林銀驥 楊梅

摘要：目的 觀察云南春燥環(huán)境下小鼠一般體征以及氣管、肺組織形態(tài)的變化，探求云南春燥環(huán)境對(duì)機(jī)體津液盛缺的影響。方法 將80只SPF級(jí)昆明種小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、食物組、氣候組、氣候食物組，每天觀測(cè)記錄各組小鼠的一般生物體征，并分別于第7、14 d行氣管、肺組織病理觀察。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，食物組、氣候組、氣候食物組小鼠體重、小便量均呈不同程度減少，飲水量增加，氣候組與氣候食物組小鼠被毛稀疏少澤、情緒趨于煩躁。各組小鼠第7、14 d氣管、肺組織均出現(xiàn)不同程度的病理變化。結(jié)論 云南春燥環(huán)境下小鼠出現(xiàn)了干燥體征;小鼠氣管、肺組織發(fā)生了不同程度的異常改變。本實(shí)驗(yàn)初步探討了“燥勝則干”“燥邪傷人，首先犯肺”的內(nèi)在機(jī)理，初步為云南春燥動(dòng)物模型研制提供了部分客觀指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：云南春燥;動(dòng)物實(shí)驗(yàn);小鼠體征;組織形態(tài)

中圖分類號(hào)：R-33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2018）07-0071-04

Role of Spring-Like Yunnan Dry Environment in General Signs and

Morphology of Trachea and Lung in Mice

CHEN Chu-jun，WANG Jing-ping，WEI Niang-yi，ZHOU zi-xin，LIN Yin-ji，YANG Mei

（Yunnan Unversity of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500）

【Abstract】Objective：To observe changes of general signs，morphological changes of trachea and lung under the conditions of spring-like Yunnan dry environment，and to explore the environmental effects on body fluids. Methods：80 specific-pathogen-free（SPF）Kunming mice were randomly divided into a normal control group，food group，climate group，and food under climate group. The general biological signs of all mice were observed and recorded every day. The pathological status of trachea and lung were accessed 7 and 14 days of treatment. Results：The body weight and urine volume decreased and the water intake volume increased in the food group，the climate group，and the food under climate group in comparison to the normal control group. The mice in the climate group and the food under climate group had sparse and coarse hairs，and tended to be irritable with pathological changes in trachea and lung 7 and 14 days post-treatment. Conclusion：The dryness symptoms occurs in mice under the spring-like Yunnan dry environment. The abnormal changes of trachea and lung tissues in mice occurred in different levels. The study preliminarily discusses the mechanism of “domination of dryness causing dry” and “dryness as detrimental to body and lungs as the first victim” and establish some objective parameters for the spring-like Yunnan dry animal model.

【Key words】spring-like Yunnan dry environment，animal experiments，signs in mice，histomorphology

燥證是一類以津液的減少，甚至枯竭干涸為主要病機(jī)，以干燥性癥狀為主要表現(xiàn)的一組中醫(yī)證候。外燥證與環(huán)境因素密切相關(guān)。云南省大部分地區(qū)處于低緯度高海拔區(qū)域，具有冬春干旱、夏秋多雨的氣候特征，燥證多發(fā)于春季。其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。建立合理、穩(wěn)定的春燥動(dòng)物模型是進(jìn)一步研究春燥多發(fā)的前提和基礎(chǔ)。本研究通過(guò)模擬云南春燥環(huán)境，觀察該環(huán)境下小鼠體表特征及肺系組織形態(tài)變化，從宏觀體征及組織形態(tài)學(xué)層面，初步探究云南春燥發(fā)生的內(nèi)在機(jī)理，為建立云南春燥動(dòng)物模型提供客觀指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康昆明種小鼠，雄性，體重（20±2）g，昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)：SYXK（滇）K2011-0011。

1.2 主要儀器和試劑 RGX-250人工氣候箱（上海賀杰儀器有限公司）;電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）;恒溫干燥箱（上海合恒儀器設(shè)備有限公司）;酶標(biāo)儀（Infinite M200 PRO）（瑞士Tecan公司）;石蠟切片機(jī)（Leica RM2135 Germany）;普通光學(xué)顯微鏡（Olympus）;熒光顯微鏡（尼康）;數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)（Panasonic WV-CP230）;HE染料（南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 將80只昆明種小鼠購(gòu)回，做適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、食物組、氣候組、氣候食物組，每組20只，置于人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)。各組按照表1模擬云南春燥環(huán)境“溫度-相對(duì)濕度-風(fēng)-食物”綜合刺激造模。

表1 “溫度-相對(duì)濕度-風(fēng)-食物”處理?xiàng)l件（x±s）

1.3.2 小鼠一般體征的觀察 每組實(shí)驗(yàn)小鼠從施加因素第1 d起，每日定時(shí)8時(shí)觀察記錄其體重、飲食飲水量、二便量、精神狀態(tài)、活動(dòng)度、背毛色澤等。

飲水量計(jì)算方法：實(shí)驗(yàn)小鼠1 d總飲水量為，前1 d添加總水量減去當(dāng)天剩余水量，然后再根據(jù)公式：每10 g體重小鼠1天飲水量=（10×1 d總飲水量）/總實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重，得出該組實(shí)驗(yàn)小鼠每10 g體重1 d飲水量。

飲食量計(jì)算方法：實(shí)驗(yàn)小鼠1 d總飲食量為，前1 d添加總食量減去當(dāng)天剩余食量，然后再根據(jù)公式：每10 g體重小鼠1 d飲食量=（10×1 d總飲食量）/總實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重，得出該組實(shí)驗(yàn)小鼠每10 g體重1 d飲食量。

小便量計(jì)算方法：從施加因素的第1 d開(kāi)始稱取干燥墊料的重量，第2 d稱取濕墊料的總重量，然后在恒溫干燥箱中使用65℃烘干120 min后，取出冷卻，稱取干重。然后根據(jù)公式“總小便量=墊料濕重-墊料干重”，計(jì)算得出這一組小鼠總小便量，最后根據(jù)公式“每10 g體重小鼠1 d小便量=（10×總尿量）/總實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重”，得出該組實(shí)驗(yàn)小鼠每10 g體重的小便量。

大便量計(jì)算方法：準(zhǔn)備工作同小便量計(jì)算。而后根據(jù)公式“總大便量=墊料干重量-前1 d干燥墊料的重量”，計(jì)算得出這一組小鼠總大便量，最后根據(jù)公式“每10 g體重小鼠1 d大便量=（10×總大便量）/總實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重”，得出該組實(shí)驗(yàn)小鼠每10 g體重的大便量。

1.3.3 小鼠氣管、肺組織切片 每組實(shí)驗(yàn)小鼠分別在第7 d和第14 d上午取材，取材前12 h禁食禁水。常規(guī)頸椎脫臼處死實(shí)驗(yàn)小鼠，取小鼠氣管1.5 cm，從右肺中部切取厚度約2～3 mm肺組織。待檢組織置10%甲醛固定，梯度脫水，石蠟切片，常規(guī)HE染色與光鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 云南春燥環(huán)境下小鼠一般體征的變化 （1）正常對(duì)照組小鼠，精神狀態(tài)良好，活潑好動(dòng)，被毛光澤，大便質(zhì)軟，無(wú)打斗現(xiàn)象。（2）食物組小鼠，在施加因素的過(guò)程中，小鼠精神狀態(tài)尚可，被毛相對(duì)光澤，與正常對(duì)照組相比體重組略有減輕，飲水量略有增加，飲食量增加，小便量減少，大便質(zhì)地略有干燥，未見(jiàn)打斗現(xiàn)象。（3）氣候組小鼠，在施加因素的過(guò)程中，精神逐漸表現(xiàn)出煩躁趨勢(shì)，被毛稀疏缺少光澤，與正常對(duì)照組相比體重明顯減輕，飲水量明顯增加，飲食量略有增加，小便量減少，大便尚可，見(jiàn)打斗現(xiàn)象，尾部有抓痕。（4）氣候食物組，在施加因素后，情緒略顯煩躁，被毛缺少易脫落、少澤，與正常對(duì)照組相比體重減輕，飲水量增加，飲食量減少，小便量略有減少，大便質(zhì)地較干，前期偶有打斗現(xiàn)象，尾部可見(jiàn)抓痕。

各組小鼠14天體重變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1;各組小鼠14 d飲水量變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2;各組小鼠14 d飲食量變化趨勢(shì)見(jiàn)圖3;各組小鼠14 d小便量變化趨勢(shì)見(jiàn)圖4;各組小鼠14 d大便量變化趨勢(shì)見(jiàn)圖5。

圖1 各組小鼠體重變化趨勢(shì)

圖2 各組小鼠飲水量變化趨勢(shì)

圖3 各組小鼠飲食量變化趨勢(shì)

圖4 各組小鼠小便量變化趨勢(shì)

圖5 各組小鼠大便變化趨勢(shì)

從結(jié)果可看出，與正常對(duì)照組比較，食物組、氣候組與氣候食物組各組小鼠均不同程度出現(xiàn)體重減輕，小便減少，飲水量增加等現(xiàn)象。其中，食物干預(yù)的2組（食物組、氣候食物組）小鼠大便干燥明顯;氣候因素干預(yù)的2組（氣候組、氣候食物組）小鼠，情緒煩躁、打斗，被毛稀疏少澤現(xiàn)象更甚。

2.2 云南春燥環(huán)境下小鼠氣管、肺組織形態(tài)的變化

2.2.1 云南春燥環(huán)境下小鼠氣管組織形態(tài)的變化 結(jié)果顯示：（1）正常對(duì)照組：第7 d氣管官腔形態(tài)規(guī)則，黏膜層纖毛排列整齊，黏膜下層未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管未見(jiàn)擴(kuò)張、充血瘀血;第14 d，氣管局部黏膜層輕微損傷。（2）食物組：第7 d，局部黏膜層褶皺，部分黏膜層纖毛損傷脫落，黏膜下層有局限性小灶性炎癥;第14 d，部分黏膜層褶皺、纖毛損傷脫落，黏膜層偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。（3）氣候組：第7 d，黏膜層部分纖毛脫落，部分增生，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層見(jiàn)少許炎性細(xì)胞，血管擴(kuò)張，充血瘀血;第14 d，黏膜層損傷，纖毛脫落，局部褶皺突起成指狀突狀，黏膜層和黏膜下層可見(jiàn)炎性細(xì)胞，血管充血瘀血。（4）氣候食物組，第7 d，黏膜層局部纖毛損傷脫落，黏膜下層見(jiàn)少許炎性細(xì)胞，血管輕微擴(kuò)張，充血瘀血;第14 d，部分黏膜層局部損傷，纖毛脫落，黏膜下層可見(jiàn)炎性細(xì)胞，血管擴(kuò)張、充血瘀血。

從結(jié)果可看出，與正常對(duì)照組比較，食物組、氣候組與氣候食物組各組小鼠的氣管組織均出現(xiàn)不同程度的黏膜增生、纖毛損傷及炎性細(xì)胞。其中，氣候組與氣候食物組二組的黏膜下層均可見(jiàn)血管擴(kuò)張及充血，且以第14天最明顯。

2.2.2 云南春燥環(huán)境下小鼠肺組織形態(tài)的變化 結(jié)果顯示：（1）正常對(duì)照組：第7天支氣管結(jié)構(gòu)完整清晰，黏膜層輕度增生，肺泡壁完整，僅有少許充血;第14 d，肺泡及細(xì)支氣管組織，未見(jiàn)明顯水腫充血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分支氣管腔內(nèi)可見(jiàn)少許脫落的支氣管上皮細(xì)胞。（2）食物組：第7 d，部分支氣管壁上皮輕微脫落，肺泡破裂，肺泡壁增厚，肺泡壁毛細(xì)血管充血瘀血，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);第14 d，部分支氣管壁上皮脫落，部分肺泡壁毛細(xì)血管充血瘀血，有少許炎性細(xì)胞散在肺泡腔內(nèi)，見(jiàn)少許肺大泡。（3）氣候組：第7 d，支氣管黏膜增生伴上皮脫落，見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁毛細(xì)血管充血瘀血，局部微量出血;第14 d，支氣管黏膜增生伴上皮脫落，肺泡壁毛細(xì)血管充血瘀血，局部少量出血，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。（4）氣候食物組，第7 d，部分支氣管壁上皮些許脫落，肺泡壁毛細(xì)血管充血瘀血、少量出血;第14 d，支氣管黏膜層損傷，有少許上皮脫落，肺泡壁充血瘀血，并見(jiàn)少量出血，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺大泡。

從結(jié)果可看出，與正常對(duì)照組比較，食物組、氣候組與氣候食物組各組小鼠的肺組織均出現(xiàn)不同程度的支氣管壁上皮脫落，肺泡壁毛細(xì)血管充血、瘀血、出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討論

3.1 云南春燥實(shí)驗(yàn)的施加因素 本實(shí)驗(yàn)采用病因造模，施加因素主要根據(jù)云南施加因素根據(jù)云南春燥的發(fā)病特點(diǎn)，結(jié)合云南獨(dú)特的方域、氣候及民俗特征來(lái)擬定。依據(jù)氣象局提供的云南省近30 a（1981-2010 a）春季氣候資料，以云南省近30年春季（3-5月）的平均最高溫度23℃作為模擬影響云南春燥環(huán)境的溫度，又以相對(duì)濕度31.5%RH（云南省近30年春季平均相對(duì)濕度為63%RH）為模擬云南春燥環(huán)境的干燥相對(duì)濕度，同時(shí)以云南省近30年春季的平均風(fēng)速2.7 m/s作風(fēng)速條件，以模擬云南春燥環(huán)境的氣候因素，施加于小鼠并進(jìn)行觀察。

另外，在前期的文獻(xiàn)調(diào)查研究中表明[1]，云南地區(qū)燥證患者除去無(wú)特殊偏嗜的因素外，以嗜食辛味（20.17%）、咸味（19.48%）者比例最高。在使用人工氣候箱模擬云南春燥氣候因素影響的同時(shí)，加以香燥食物喂食小鼠以作為影響云南春燥的飲食因素，雙重干預(yù)觀察其對(duì)小鼠的影響。

3.2 云南春燥環(huán)境對(duì)小鼠一般體征的影響 中醫(yī)有言，“視其外應(yīng)，以知其內(nèi)臟，則知所病矣”。在中醫(yī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物的外在表征觀察極為重要。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠的體征是燥證辨證的重要依據(jù)，也是進(jìn)一步檢測(cè)微觀指標(biāo)的前提依據(jù)之一。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來(lái)，與正常對(duì)照組比較，食物組、氣候組與氣候食物組各組小鼠均出現(xiàn)不同程度的體重減輕，小便量減少，飲水量增加。說(shuō)明無(wú)論在春燥外環(huán)境，抑或過(guò)食香燥食物，均能損傷小鼠津液，從而出現(xiàn)“燥勝則干”一系列表現(xiàn)。由于燥邪易先犯肺，肺與大腸相表里，因而，肺系干燥的表現(xiàn)更為突出。如食物干預(yù)的2組小鼠顯示大便干燥明顯，說(shuō)明香燥食物入里化燥，妨礙了肺肅降津液的功能，大腸失于濡潤(rùn)所致。氣候因素干預(yù)的2組小鼠則明顯出現(xiàn)被毛稀疏少澤的現(xiàn)象，說(shuō)明燥邪犯肺，肺布津失司，皮毛失潤(rùn)。小鼠出現(xiàn)情緒煩躁、打斗現(xiàn)象則與肝有關(guān)?！端貑?wèn)·至真要大論》曰：“清氣大來(lái)，燥之勝也，風(fēng)木受邪，肝病生焉?！贝杭靖螝馄?，風(fēng)氣偏盛，燥傷津液，易使小鼠肝陽(yáng)偏亢，故見(jiàn)煩躁易怒之征。

3.3 云南春燥環(huán)境對(duì)小鼠氣管、肺組織形態(tài)的影響 燥在上，必乘肺經(jīng)。燥邪從口鼻侵入機(jī)體，氣管和肺組織，屬于肺系，此乃保衛(wèi)人體之屏障。外邪侵犯，首先擾亂機(jī)體功能活動(dòng)，繼而損傷相應(yīng)組織結(jié)構(gòu)，故而機(jī)體組織形態(tài)會(huì)出現(xiàn)不同程度的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，與正常對(duì)照組比較，食物組、氣候組、氣候食物組各組小鼠的氣管均出現(xiàn)不同程度的異常改變。如，氣管組織出現(xiàn)黏膜增生、纖毛損傷及炎性細(xì)胞;肺組織見(jiàn)支氣管壁上皮脫落，肺泡壁毛細(xì)血管充血、瘀血、出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。且感燥時(shí)間越長(zhǎng)，變化愈明顯，氣候組與氣候食物組第14 d均重于第7 d。肺喜潤(rùn)惡燥，燥邪犯肺，肺津受損，宣降功能失司，隨著感燥時(shí)間延長(zhǎng)，其組織結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變愈明顯。因而，小鼠肺與氣管組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，可能作為燥傷肺津，肺失宣降的客觀指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)食物組小鼠第14 d病變輕于第7 d，這可能是由于小鼠自身適應(yīng)所致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在云南春燥環(huán)境干預(yù)下，各組小鼠均出現(xiàn)不同程度的干燥體征，各組小鼠的氣管、肺組織也發(fā)生了不同程度的異常改變。初步闡釋了“燥勝則干”“燥邪傷人，首先犯肺”的內(nèi)在機(jī)理，為云南春燥動(dòng)物模型研制提供了一部分

客觀指標(biāo)。然而，實(shí)驗(yàn)中，部分小鼠在干預(yù)以后，組織結(jié)構(gòu)沒(méi)有出現(xiàn)較明顯的病理改變。究其原因，一方面可能是本實(shí)驗(yàn)的病因造模方式，對(duì)小鼠功能影響較大，還不足以促使其組織結(jié)構(gòu)發(fā)生較明顯的病理改變。另一方面，也可能實(shí)驗(yàn)過(guò)程中某些因素把握不夠精準(zhǔn)，或考慮不周全所致。如，干預(yù)時(shí)間、施加因素、小鼠對(duì)環(huán)境的適應(yīng)等等。這將是后期實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步摸索的問(wèn)題。以期在此基礎(chǔ)上，通過(guò)不斷地探索，最終研制出合理、穩(wěn)定、可復(fù)制的云南春燥動(dòng)物模型。

參考文獻(xiàn)：

[1]張艷.云南燥證證機(jī)研究[D].昆明：云南中醫(yī)學(xué)院，2015.

（收稿日期：2019-03-19）