程 潔 田叢娜 尉 靜 吳永生 谷建琦 康 林

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJ OA）是以關(guān)節(jié)軟骨的破壞與耗損為主要特征，伴發(fā)軟骨下骨組織改建和滑膜相應(yīng)病變的一種退行性疾病[1]，是顳頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征中最常見的類型之一，其臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)彈響、疼痛和運(yùn)動受限，其病因復(fù)雜，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為壓力負(fù)荷過大是其主要病因[2，3]。TMJ OA的病理學(xué)特征表現(xiàn)為軟骨的退化，軟骨下骨改建和滑膜組織的慢性炎癥，但其發(fā)病機(jī)制尚需進(jìn)一步研究[4，5]。TMJ受到牽張力、壓力，剪切力等外界刺激時(shí)，應(yīng)力如果超出生理性范圍，髁突軟骨內(nèi)軟骨細(xì)胞及其外周細(xì)胞基質(zhì)的代謝平衡則會被打破，引起細(xì)胞增殖的加強(qiáng)或細(xì)胞凋亡的趨勢[6，18]。IRE1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路特有的凋亡因子，當(dāng)外界刺激所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)啟動后，IRE1通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路經(jīng)過一系列的級聯(lián)反應(yīng)激活caspase-12，引起細(xì)胞凋亡反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠單側(cè)咀嚼的造模，研究髁突軟骨細(xì)胞中由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白IRE1和caspase-12的表達(dá)變化。

資料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動物的選擇與分組：使用河北醫(yī)科大學(xué)動物中心提供的3周齡雄性SD大鼠48只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為8組，實(shí)驗(yàn)組及對照組各4組，每組6只。

2.動物模型的建立與取材：各實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)10%水合氯醛4ml/kg腹腔注射麻醉后，固定頭部，拔除左側(cè)上、下頜所有磨牙，拔牙后1d，7d，14d，28d處死。完整取材雙側(cè)髁突軟骨組織，立即于-80℃冰箱保存。對照組大鼠不做拔牙處理，與對應(yīng)實(shí)驗(yàn)組同期處死。

3.下頜運(yùn)動方式的觀察：觀察大鼠靜止時(shí)的上、下頜中線位置是否一致，拔牙處理后，觀察拔牙大鼠咀嚼時(shí)下頜的運(yùn)動方式，下頜切點(diǎn)運(yùn)動時(shí)偏向左側(cè)和右側(cè)的頻率。

4.實(shí)時(shí)定量PCR檢測：取雙側(cè)髁突軟骨，于-80℃保存，用Trizol提取組織樣本中總RNA。取5μlRNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測RNA的完整性。用天根生物科技有限公司的TIANScript RT KIT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。設(shè)計(jì)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，β-actin用作內(nèi)定參考。PCR 反應(yīng)程序：95℃15min，95℃10s，58℃30s，72℃30s，循環(huán)40次。分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60℃～95℃進(jìn)行溶解曲線分析，引物序列見表1。

用熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。根據(jù)RealTimePCR原始檢測結(jié)果，按照 2-△△ct相對定量計(jì)算公式，即：△△Ct＝[Ct目的基因（實(shí)驗(yàn)組）－CtBeta基因（實(shí)驗(yàn)組）]-[Ct目的基因（對照組）－CtBeta基因（對照組）]。計(jì)算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對于對照樣品目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

表1 PCR引物序列

5.統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析法，比較不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組左、右側(cè)及對照組髁突軟骨IRE1和caspase-12的表達(dá)情況及各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)同側(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的IRE1和caspase-12的表達(dá)情況。

結(jié) 果

1.下頜切點(diǎn)運(yùn)動軌跡的觀察：對照組大鼠在靜止時(shí)，上、下中線一致，咀嚼時(shí)下頜切點(diǎn)運(yùn)動軌跡向左側(cè)和右側(cè)偏向的頻率基本相等。實(shí)驗(yàn)組大鼠靜止時(shí)上、下頜中線基本一致，咀嚼時(shí)下頜切點(diǎn)的運(yùn)動軌跡明顯偏向右側(cè)（非拔牙側(cè)）。

2.RT-PCR檢測結(jié)果：因?qū)φ战M髁突軟骨中IRE1和caspase-12的含量在不同時(shí)間點(diǎn)的左右側(cè)對比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），所以將不同時(shí)間點(diǎn)對照組的左、右側(cè)合并為一組。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)IRE1的含量在1d，7d，14d，28d時(shí)均高于對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組右側(cè)IRE1含量1d，7d，14d時(shí)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組左、右側(cè)1d時(shí)IRE1含量無顯著性差異（P＞0.05），在 7d，14d，28d 均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。隨時(shí)間延長，對照組IRE1含量無明顯變化（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組左側(cè)含量逐漸升高（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組右側(cè)IRE1含量逐漸降低，到28d時(shí)與對照組已無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1）。caspase-12的變化趨勢與IRE1相同，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)caspase-12含量在1d，7d，14d，28d時(shí)均高于對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組右側(cè)caspase-12含量在1d，7d，14d，28d時(shí)均高于對照組， 1d，7d，14d時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨時(shí)間延長，對照組caspase-12含量無明顯變化，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)含量逐漸升高，在14d，28d時(shí)升高較前一時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組右側(cè)caspase-12含量逐漸降低，在7d，28d時(shí)降低較前一時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），28d時(shí)與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖 2）。

圖1 拔牙后IRE1含量變化

圖2 拔牙后caspase-12含量改變

討 論

顳下頜關(guān)節(jié)（TMJ）作為人體唯一保持終身改建能力的關(guān)節(jié)，其所承受的負(fù)荷與改建活動密切相關(guān)，而咬合力的改變則是TMJ負(fù)荷變化的直接來源。牙齒缺失后，咬合接觸面積及保留牙齒的咬合力的改變產(chǎn)生不同的應(yīng)力，這種應(yīng)力改變沿下頜骨的應(yīng)力軌跡傳導(dǎo)至髁突軟骨，打破了髁突軟骨內(nèi)的細(xì)胞代謝平衡。有實(shí)驗(yàn)研究表明[7，10]，生理性的力學(xué)刺激促進(jìn)細(xì)胞增殖，膠原合成代謝、血管再生活躍，軟骨厚度增加，而過大或過小的力學(xué)刺激，則會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)一步導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎癥狀的出現(xiàn)。不同的機(jī)械力刺激，髁突軟骨中所含的各種不同類型的膠原的含量比例也會改變，以適應(yīng)新的力學(xué)環(huán)境[5，8]。已有很多學(xué)者對雙側(cè)TMJ受力不均衡時(shí)引起的髁突軟骨組織形態(tài)學(xué)和細(xì)胞及基質(zhì)代謝的變化做了研究，這些研究大多選用的發(fā)育期大鼠，因此對我們進(jìn)一步研究髁突的生長發(fā)育及其影響因素都有很多幫助[9，17]。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組大鼠左側(cè)上、下頜所有磨牙缺失，對下頜切點(diǎn)運(yùn)動軌跡的觀察結(jié)果與李波[11]等建立的大鼠偏側(cè)咀嚼習(xí)慣模型的結(jié)果一致。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)精確的膜系統(tǒng)，是蛋白質(zhì)合成和運(yùn)輸?shù)闹匾獔鏊鵞12]，也是細(xì)胞凋亡反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），是指在缺氧，氧化應(yīng)激，異常糖基化反應(yīng)以及鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤折疊與未折疊的蛋白質(zhì)會明顯增多，當(dāng)超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力時(shí)，細(xì)胞會激活一些相關(guān)信號級聯(lián)反應(yīng)，來應(yīng)對條件的變化和恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)良好的蛋白質(zhì)折疊環(huán)境。因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對于增強(qiáng)細(xì)胞對損傷的抵抗和適應(yīng)能力有重要意義，對細(xì)胞的存亡有重要影響。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要存在三種信號通路：未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)（EOR），固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)。UPR對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)最初是一種保護(hù)機(jī)制，既減少蛋白蛋白質(zhì)合成，從而減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)，還可促進(jìn)伴侶蛋白如GRP78、鈣聯(lián)接蛋白、Bip、CHOP等的表達(dá)。IRE1是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜糖蛋白，具有絲氨酸、蘇氨酸受體蛋白激酶活性和核糖核酸內(nèi)切酶活性，能識別未折疊蛋白的蓄積，是UPR中的重要通路，可跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)行UPR信號傳遞。caspase-12是半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞漿面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可激活caspase-12，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組左側(cè)的IRE1和caspase-12含量明顯高于對照組。正常狀態(tài)下，發(fā)生UPR時(shí)，IRE1蛋白形成二聚體，激活I(lǐng)RE1蛋白激酶活性并發(fā)生磷酸化，磷酸化激活I(lǐng)RE1的核酸內(nèi)切酶活性，進(jìn)而誘導(dǎo)分子伴侶蛋白如BIP、CHOP、GRP78等和折疊酶基因的表達(dá)，加快蛋白折疊和錯(cuò)誤蛋白降解。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組左側(cè)磨牙缺失后，大鼠左側(cè)髁突軟骨缺乏正常的應(yīng)力刺激，細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡被破壞，隨著時(shí)間推移，檢測出的凋亡相關(guān)蛋白含量的顯著升高。這一結(jié)果說明當(dāng)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白增多即產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，IRE1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的伴侶分子蛋白解離，IRE1自身磷酸化，刺激傳導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)死亡信號的激活，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的凋亡機(jī)制較為特殊，可特異性的激活caspase-12，caspase-12進(jìn)而激活caspase-9，caspase-9激活caspase-3，進(jìn)入最終細(xì)胞凋亡通路。而實(shí)驗(yàn)組右側(cè)的IRE1和caspase-12含量在1d、7d組顯著高于對照組，但隨時(shí)間的延長，這兩種凋亡相關(guān)蛋白均出現(xiàn)了逐漸下降的趨勢，分析其原因可能是開始的凋亡因子含量的增高與拔牙后的創(chuàng)傷導(dǎo)致的炎性反應(yīng)有關(guān)，且突然增加的過大的應(yīng)力負(fù)荷會引起顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病樣改變[13]，表現(xiàn)為軟骨的退化。而隨時(shí)間推移，右側(cè)的髁突軟骨發(fā)生了適應(yīng)性改建，細(xì)胞的凋亡反應(yīng)逐漸減少，IRE1和caspase-12含量也隨之降低。這一結(jié)果也與以往的研究結(jié)果基本一致[14～16]，缺乏正常應(yīng)力刺激對發(fā)育期大鼠髁突軟骨的細(xì)胞增殖無顯著性改變，但對細(xì)胞凋亡有明顯的促進(jìn)作用，進(jìn)而影響髁突的正常發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，IRE1和caspase-12含量的變化，也證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路是髁突軟骨細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。