劉樂天 毛立民 王海俠 黃宇思

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，約占口腔惡性腫瘤的90%，是具有不同分化程度的鱗狀上皮性惡性腫瘤，具有較高的侵襲性和早期廣泛淋巴結轉移傾向。當前治療口腔鱗癌的以手術、放療和化療為主的綜合序列治療，雖然取得了一定程度的進步，但并未顯著提高口腔鱗癌患者特別是已發(fā)生局部淋巴結轉移的晚期腫瘤患者的五年生存率。因此，尋找新的可能與口腔鱗癌有關的生物標志物，闡明其侵襲和轉移的機制，對于口腔鱗癌的防治具有積極意義。

富含絲氨酸/精氨酸剪接因子1（SRSF1）是SR蛋白家族的重要成員，參與前體蛋白mRNA的多種生理過程和腫瘤相關基因剪接的調控，通過調控腫瘤細胞的凋亡和增殖參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1]。其參與調節(jié)相當多的生物學途徑，包括mRNA的剪接、穩(wěn)定和翻譯，miRNA的加工，蛋白質的SUMO化和核仁應激反應等[2]，是第一個被證實與腫瘤直接相關的剪接因子[3]。caspase-3是caspase蛋白酶家族的重要成員，無論是內源性還是外源性凋亡途徑，均需通過激活caspase-3誘導細胞凋亡，是凋亡執(zhí)行的重要效應因子。目前關于SRSF1在口腔鱗癌中的表達及意義尚未見報導，其在口腔鱗癌中的表達機制及其與caspase-3蛋白在口腔鱗癌中的表達及相互作用亦不明確。本研究旨在通過檢測SRSF1及caspase-3在口腔鱗癌中的表達情況，探討二者在口腔鱗癌發(fā)生及發(fā)展中的作用及二者之間的相關性，為口腔鱗癌的臨床診斷、治療和判斷腫瘤預后提供理論依據。

資料和方法

1.一般資料

所有標本均來自2016年10月到2017年12月之間的哈爾濱醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科存檔的經口腔頜面外科手術中切取的組織標本（福爾馬林固定，石蠟包埋），標本均經兩名病理科醫(yī)師雙盲法閱片明確診斷結果。共69例口腔鱗癌病例，男49例，女20例，其中舌來源28例、牙齦12例，口底11例，唇6例，頰5例，其他來源6例，男49例，女20例。高分化鱗癌23例，男14例，女9例，年齡43～75歲；中分化鱗癌23例，男15例，女8例，年齡35～83歲；低分化鱗癌23例，男20例，女3例，年齡42～73歲。從口腔外科其他手術切取的正常口腔黏膜組織10例，男6例，女4例。4組年齡、性別比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.方法

（1）主要試劑：兔抗人SRSF1蛋白多克隆抗體、兔抗人caspase-3多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。SP免疫組化試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

（2）檢測方法：免疫組織化學SP法，一抗稀釋度經預實驗檢測均為1:200，用SP法免疫組化試劑盒操作，操作步驟根據試劑盒說明進行，每組實驗均以PBS代替一抗作為陰性對照。

（3）結果判定：SRSF1蛋白染色陽性細胞為細胞核內呈現(xiàn)棕黃（褐）色，caspase-3蛋白染色陽性細胞為細胞質內呈現(xiàn)棕黃（褐）色。每張切片在高倍鏡視野下計數細胞，按染色強度打分：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。按陽性細胞百分比打分：陰性記0分，陽性細胞1%～10%記1分，11%～50%記2分，51%～75%記3分，＞75%記4分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積≥3分為免疫反應陽性。

3.統(tǒng)計學處理

應用SPSS22.0對數據進行處理，采用χ2檢驗和四格表的精準概率法判斷SRSF1和caspase-3表達與各病理指標的相互關系，采用Spearman法分析SRSF1及caspase-3表達的相關性，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.SRSF1蛋白檢測結果

SRSF1蛋白主要定位于細胞核，在光鏡下可見癌組織內細胞核呈不同程度的棕黃顆粒。SRSF1蛋白在OSCC和正常口腔黏膜上皮中的陽性表達率分別為75.4%（52/69）和40%（4/10）。兩者之間的表達有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SRSF1蛋白在低分化鱗癌中的陽性率95.7%（22/23）高于中分化鱗癌的陽性率69.6%（16/23），而后者的陽性率高于高分化鱗癌60.9%（14/23），在三種病理分級的組織中表達有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SRSF1在有淋巴結轉移的陽性表達率為92%（23/25），高于未見淋巴結轉移中的陽性率65.9%（29/44），其表達與淋巴結是否轉移有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）見表1。SRSF1在OSCC組織中的陽性表達情況見圖1。

圖1 SRSF1在口腔鱗癌組織中的陽性表達（DAB，×200 ×400）

表1 SRSF1在口腔鱗癌中的表達及其與淋巴結轉移的關系

2.caspase-3蛋白檢測結果

Caspase-3蛋白主要表達于細胞質，在光鏡下可見陽性表達細胞的胞質內呈不同程度的棕黃顆粒。其在OSCC和正?？谇火つど掀ぶ械年栃员磉_率分別為 31.9%（22/69）和 90.0%（10/69），兩者之間的表達有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Caspase-3蛋白表達與腫瘤的病理分級有關（P＜0.05），在低分化鱗癌中的陽性率13.0%（3/23）低于中分化鱗癌的陽性率30.4%（7/23），而后者的陽性率低于高分化鱗癌52.2%（12/23）。經檢測，caspase-3蛋白的表達與腫瘤是否存在淋巴結轉移無統(tǒng)計學關系（P＞0.05）見表2。Caspase-3在OSCC組織中的陽性表達情況見圖2。

圖2 caspase-3在OSCC組織中的陽性表達（DAB，×200 ×400）

表2 caspase-3在口腔鱗癌中的表達及其與淋巴結轉移的關系

3.SRSF-1與caspase3表達的相關性

52例SRSF1表達陽性的OSCC組織中有36例Caspase3表達陰性（36/52，69.2%），而 17例 SRSF1表達陰性組織中有10例Caspase-3陽性表達（10/17，58.8%），兩種蛋白表達均為陽性16例，兩種蛋白表達均為陰性7例，進行相關性分析（Pearson相關系數 r＝-0.249，P＝0.039，P＜0.05） 見表 3，提示OSCC組織中SRSF1與Caspase-3表達呈負相關。

表3 口腔鱗癌中SRSF1與caspase-3表達的關系

討 論

富含絲氨酸/精氨酸蛋白即SR蛋白是一組參與基因組成性剪接和選擇性剪接的系統(tǒng)發(fā)育保守的蛋白質家族[4]。其在基因表達各個步驟的相互作用中起到了額外的作用[5]。絲氨酸/精氨酸剪接因子1（SRSF1，也稱為SF2/ASF）是剪接調節(jié)劑的SR蛋白家族的成員。其在維持細胞的基本生命活力方面發(fā)揮重要作用。同時，SRSF1可以通過識別和結合外顯子剪接增強子（ESE）來調節(jié)選擇性剪接，近年來的研究表明其參與調節(jié)mRNA穩(wěn)定性、輸出、無義介導的mRNA衰減、翻譯和miRNA的加工[6]。SRSF1調節(jié)選擇性剪接事件被認為有助于腫瘤的發(fā)生。其在惡性腫瘤中可以調節(jié)細胞的運動和侵襲，可能與腫瘤的轉移有關[7]。同時，SRSF1的失活或丟失會導致G2期細胞周期停滯和程序性細胞死亡，對于維持腫瘤的早期穩(wěn)定性起到了至關重要的作用[8]。SRSF1被認為是一種原癌蛋白，在既往研究中被證明在乳腺腫瘤中的表達水平上調，并通過調節(jié)選擇性剪接促進乳腺細胞的轉化[9]。此外，其在肺腫瘤、結腸腫瘤、小腸腫瘤、腎腫瘤、甲狀腺腫瘤、肝腫瘤、胰腺腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及急性淋巴細胞白血病中存在過表達現(xiàn)象[10～15]。

Caspase（cysteinyl aspartate specific proteinase）家族，即半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族，是細胞凋亡過程中重要的凋亡促進因子。當Caspase蛋白活性受抑制可誘發(fā)細胞凋亡障礙，即細胞與增殖間動態(tài)平衡失調，可能促進多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展。而Caspase-3是Caspase家族中的最重要凋亡者之一，可以通過細胞內或細胞外途徑促進細胞的凋亡[16]，是凋亡過程中的主要效應因子，同時其是引起細胞凋亡的最下游成分。它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志[17]。

現(xiàn)有學者研究證實SRSF1與細胞凋亡因子之間存在作用關系[18]，其可以通過調控Bcl-X和caspase激活的DNA酶抑制蛋白（inhibitor of caspase activated DNase，ICAD）的剪接影響腫瘤細胞的生長與凋亡[19]。在人非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，SRSF1 可以增加抗凋亡蛋白survivin mRNA的穩(wěn)定性，提高其翻譯活性和表達，通過抑制促凋亡的caspse蛋白抑制肺癌細胞的凋亡[20]。同時本研究結果顯示 SRSF1及caspase-3在口腔鱗癌組織中的表達呈負相關（r＝-0.249，P＝0.039，P＜0.05），表明 SRSF1 可能通過某種通路抑制了caspase-3蛋白的表達，提示二者關系密切，共同調控口腔鱗癌細胞的凋亡，并在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，SRSF1在口腔鱗癌組織中高表達，且其表達程度與病理分級以及腫瘤的轉移有關。Caspase-3蛋白與SRSF1的表達程度呈負相關。提示SRSF1可以作為新的腫瘤標志物，與caspase-3聯(lián)合用作口腔鱗癌的診斷、治療以及預后狀況的判斷。