高聰 張宇 陳云飛 劉兵

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 1.急診外科，2.肝膽外科，四川 成都 610072)

肝硬化是飲食、精神狀態(tài)及代謝性疾病等致病因素長(zhǎng)期反復(fù)作用于肝臟導(dǎo)致的慢性肝損害，患者易并發(fā)膽囊結(jié)石。在我國(guó)，膽囊結(jié)石發(fā)病率約為10%，而肝硬化并發(fā)膽囊結(jié)石患者因全身狀況不佳不允許手術(shù)，藥物治療療效差或反復(fù)發(fā)作，因此預(yù)防肝硬化患者發(fā)生膽囊結(jié)石需從其病理方面深入研究[1-2]。膽汁中成分改變?yōu)槟懩医Y(jié)石形成的重要原因，當(dāng)膽汁酸減少時(shí)，可直接或間接影響膽汁中膽固醇狀態(tài)，形成結(jié)石[3]。膽汁中膽汁酸、磷脂、直接膽紅素(Direct bilirubin,DBIL)等的分泌受法尼醇受體(FXR)、膽鹽輸出泵(BSEP)、多耐藥相關(guān)蛋白(MRP)的調(diào)節(jié)，其中FXR作為膽汁酸受體可調(diào)節(jié)膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及重吸收，減少膽汁淤積[4-5]。Wang YD等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，肝臟細(xì)胞中的胞質(zhì)為BSEP的儲(chǔ)存庫(kù)，其BSEP量為肝細(xì)胞膽管側(cè)膜的6倍，體內(nèi)BSEP主要通過肝細(xì)胞膽管膜轉(zhuǎn)運(yùn)膽鹽，而減少肝臟內(nèi)膽汁潴留、瘀積，且FXR可調(diào)節(jié)BSEP、MRP活性[7]。因此，本研究在既往研究基礎(chǔ)上，推測(cè)FXR、BSEP、MRP引起的膽汁酸代謝異常可能與肝硬化并發(fā)膽囊結(jié)石有關(guān)，旨在為預(yù)防肝硬化并發(fā)膽囊結(jié)石提供病理依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2015年4月～2017年5月我院收治的肝硬化并發(fā)膽囊結(jié)石患者40例、單純膽囊結(jié)石患者36例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①肝硬化患者依據(jù)肝炎病史及血清乙肝病毒感染標(biāo)記陽(yáng)性，且具有肝硬化臨床表現(xiàn)、生化與影像學(xué)輔助檢查證實(shí)為肝硬化，并于術(shù)中行肝臟活檢，病理證實(shí)為肝硬化。②所有患者均經(jīng)CT或腹部超聲明確有膽囊結(jié)石。③麻醉分級(jí)(ASA)Ⅰ～Ⅱ級(jí)，且同意術(shù)后留取標(biāo)本并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①梗阻性黃疸、合并膽總管結(jié)石、肝內(nèi)膽管結(jié)石及其他膽道疾病者。②有肝切除術(shù)或膽道手術(shù)史。③合并全身免疫系統(tǒng)疾病或近1周服用過熊去氧膽酸、利膽藥者。將肝硬化并發(fā)膽囊結(jié)石患者納入研究組，單純膽囊結(jié)石患者納入對(duì)照組，研究組中男性18例，女性22例，年齡18～60歲，平均(38.56±4.11)歲，ASA分級(jí)：Ⅰ級(jí)21例，Ⅱ級(jí)19例；對(duì)照組中男性17例，女性19例，年齡19～58歲，平均(38.50±4.15)歲，ASA分級(jí)：Ⅰ級(jí)19例，Ⅱ級(jí)17例，兩組在性別、年齡、ASA分級(jí)等一般資料方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究征得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 研究方法

1.2.1 術(shù)前檢查及標(biāo)本采集 均于手術(shù)前1d抽血化驗(yàn)生化全項(xiàng)目，統(tǒng)計(jì)其總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總膽汁酸(TBA)，術(shù)中切取肝緣約1.0cm2肝組織，采集標(biāo)本后立即保存于福爾馬林液中，并在24h內(nèi)制成石蠟切片。

1.2.2 主要試劑及配制 兔抗人FXR多克隆抗體(濃縮型，工作液濃度1：100)，兔抗人BSEP多克隆抗體(濃縮型，工作液濃度1：100)，兔抗人MRP2多克隆抗體(濃縮型，工作液濃度1：80)，均購(gòu)自北京奧森生物技術(shù)有限公司；SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 FXR、BSEP、MRP2表達(dá)水平測(cè)定 以4%多聚甲醛固定，銅制模具包埋組織塊，后切片、脫蠟、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性、抗原修復(fù)、甩去多余液體、滴加第一抗體、滴加生物素化第二抗體、滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液、DAB顯色、蘇木素復(fù)染細(xì)胞核7(8s，后置于×400倍顯微鏡下觀察。應(yīng)用美國(guó)IMAge-Pro Plus v5.1軟件，捕獲顯微鏡采集的組織形態(tài)學(xué)圖片，選取其中陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)的5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)算，記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度，得出SP評(píng)分(IHS)的數(shù)值。SP免疫組化圖像評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)：0.0%～1%計(jì)0分，1%～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～80%計(jì)4分，81%～100%計(jì)4分。②陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度：0分：未染黃色，陰性；1分：淡黃色，弱陽(yáng)性；2分：黃色，陽(yáng)性；3分：棕黃色，強(qiáng)陽(yáng)性；IHS評(píng)分為①、②評(píng)分乘積。

1.3 觀察指標(biāo) ①對(duì)比兩組術(shù)前一天血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平。②比較兩組肝臟組織FXR、BSEP、MRP2表達(dá)水平。③分析上述指標(biāo)相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平比較 與對(duì)照組比較，研究組DBIL、TBA明顯較高，TC、TG較低(均P<0.05)，而TBIL對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平比較Table 1 The levels of serum TBIL, DBIL, TC, TG and TBA in the two groups

2.2 兩組肝臟組織FXR、BSEP、MRP2表達(dá)水平比較 研究組肝臟組織FXR、BSEP、MRP2表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

2.3 血清生化指標(biāo)FXR、BSEP、MRP2相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，肝硬化并發(fā)膽囊結(jié)石患者FXR、BSEP、MRP2與DBIL、TBA呈負(fù)相關(guān)，且FXR與BSEP、MRP2均存在正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，見表3。

Table2LivertissueFXR,BSEPandMRP2expressionlevelsinthetwogroups

組別nFXRBSEPMRP2研究組402.15±0.344.21±0.514.35±0.56對(duì)照組369.21±1.029.24±1.129.81±1.06t41.32525.61928.474P0.0000.0000.000

表3 血清生化指標(biāo)FXR、BSEP、MRP2相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of serum biochemical indexes, FXR, BSEP and MRP2

2.4 SP染色結(jié)果 研究組局部肝細(xì)胞水腫，脂肪變性，結(jié)締組織增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核也有少量表達(dá)，且研究組FXR、BSEP、MRP2表達(dá)均低于對(duì)照組，見圖1～3。

圖1 研究組、對(duì)照組FXR SP染色(×400)Figure 1 FXR SP staining in the study group and control group (x400)注：a為研究組，b為對(duì)照組

圖2 研究組、對(duì)照組BSEP SP染色(×400)Figure 2 BSEP SP staining in the study group and control group (x400)注：a為研究組，b為對(duì)照組

圖3 研究組、對(duì)照組MRP2 SP染色(×400)Figure 3 MRP2 SP staining in the study group and control group (x400)注：a為研究組，b為對(duì)照組

3 討論

膽囊結(jié)石為臨床外科常見病，患者常因膽絞痛、急性膽囊炎而就診，嚴(yán)重者可出現(xiàn)膽囊壞疽、穿孔，膽囊結(jié)石一旦進(jìn)入膽總管內(nèi)，可致急性膽管炎、急性胰腺炎等，嚴(yán)重者危及生命[8]。膽囊結(jié)石的發(fā)生與肝硬化程度及病程密切相關(guān)，王子晨等[9]的調(diào)查結(jié)果顯示，肝硬化患者合并膽囊結(jié)石發(fā)生率為21.3%，明顯高于正常體檢者單純膽囊結(jié)石發(fā)生率的5.6%，且肝功能分級(jí)、DBIL、TG等是肝硬化并發(fā)膽囊結(jié)石的危險(xiǎn)因素，因而探討肝硬化患者并發(fā)膽囊結(jié)石的發(fā)病機(jī)制有助于改善其肝功能，減少結(jié)石形成率[10]。膽汁酸為膽汁重要成分，經(jīng)肝臟合成后分泌至膽囊或腸道中，正常情況下膽汁中膽固醇、膽汁酸及磷脂維持一定比例的動(dòng)態(tài)平衡，而肝硬化時(shí)，肝細(xì)胞受損，肝內(nèi)酶不足，膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化減少，使膽汁酸分泌減少，膽汁酸的減少也會(huì)使膽固醇溶解降低，膽固醇從膽汁中析出結(jié)晶，形成膽固醇結(jié)石，同時(shí)膽汁酸也是膽紅素重要助溶劑，膽汁酸含量降低時(shí)將影響膽汁中游離膽紅素溶解度，使膽汁酸與鈣離子結(jié)合力減小，繼而形成膽色素結(jié)石，因此肝硬化患者膽汁中膽汁酸濃度的改變?yōu)槟懩医Y(jié)石形成創(chuàng)造了條件，對(duì)研究膽汁酸代謝異常機(jī)制有重要意義[11-12]。膽汁形成及分泌與肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密切相關(guān)，其中一些蛋白如轉(zhuǎn)運(yùn)膽鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)子BSEP、MRP2等在膽囊結(jié)石形成中的作用已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到充分印證[13-14]，但BSEP、MRP2與人體膽囊結(jié)石尤其是肝硬化并發(fā)膽囊結(jié)石的關(guān)系研究較少[15]。孔凡民等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，膽囊結(jié)石患者的肝組織中BSEP、MRP2表達(dá)較正常肝組織減少，光密度平均值分別為(0.47±0.18)、(1.12±0.39)，提示BSEP、MRP2在人體膽囊結(jié)石形成中發(fā)揮作用。FXR則是主要表達(dá)于肝臟的典型核受體結(jié)構(gòu)，DNA結(jié)合域與靶基因上FXR反應(yīng)元件結(jié)合后發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，其活化可負(fù)反饋調(diào)節(jié)膽汁酸合成，Liu J等[17]在分析膽汁酸對(duì)原代肝細(xì)胞膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在膽汁酸限速酶存在時(shí)，F(xiàn)XR作為主要靶基因有增加趨勢(shì)，同時(shí)膽汁酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)Na+?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽不受影響，而BSEP提高了15倍，MRP2也增加，可見FXR、BSEP、MRP2均可能參與膽汁酸代謝調(diào)控。

本次研究在既往研究基礎(chǔ)上，分析了肝硬化合并膽囊結(jié)石患者(研究組)、單純膽囊結(jié)石患者(對(duì)照組)在術(shù)前一天血清生化指標(biāo)及FXR、BSEP、MRP2表達(dá)水平。結(jié)果顯示，研究組血清DBIL、TBA明顯高于對(duì)照組，而TC、TG明顯低于對(duì)照組，且研究組FXR、BSEP、MRP2均較對(duì)照組低，這與張亮亮等[18]的報(bào)道結(jié)果相近，證實(shí)肝硬化并發(fā)膽囊結(jié)石患者存在明顯的膽汁酸代謝異常。原因在于肝細(xì)胞血竇面基底膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括有機(jī)陰離子、BSEP、MRP2等轉(zhuǎn)運(yùn)膽汁相應(yīng)成分進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，再經(jīng)與蛋白質(zhì)結(jié)合或細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散方式運(yùn)輸至肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜，后進(jìn)入毛細(xì)膽管內(nèi)，形成膽汁；當(dāng)肝硬化時(shí)，膽鹽超載，F(xiàn)XR參與肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上MRP2轉(zhuǎn)錄的上調(diào)；FXR的活化還可誘導(dǎo)BSEP、MRP2表達(dá)，促進(jìn)膽汁酸及DBIL分泌，調(diào)節(jié)膽汁成分；此外，在快速循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，BSEP可能通過降解磷酸化、糖基化、泛酸化等蛋白質(zhì)修飾作用而保護(hù)自己，以避免被降解。同時(shí)因FXR的下調(diào)致BSEP、MRP2表達(dá)減少，肝臟分泌DBIL入膽汁的能力受損，使DBIL升高，血清生化檢測(cè)可觀察到TBIL、DBIL、TBA等異常[19]。國(guó)外學(xué)者Chen WD1等[20]的研究證實(shí)，F(xiàn)XR在膽酸激活下，通過與FXR形成異二聚體，繼而與BSEP及MRP2啟動(dòng)子區(qū)的IR-1結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。而本研究結(jié)果顯示，肝硬化合并膽囊結(jié)石患者FXR與BSEP、MRP2存在正相關(guān)性，進(jìn)一步論證了FXR、BSEP及MRP2在膽汁酸代謝異常中的相互作用關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，膽汁酸代謝異常是肝硬化患者并發(fā)膽囊結(jié)石的主要病理機(jī)制，可據(jù)此開展治療預(yù)防肝硬化并發(fā)膽囊結(jié)石。