何 喻，任 瑩，叢玲華

(寧波市鄞州人民醫(yī)院病理科，浙江 寧波 315000)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌最主要的病理分型，占80%以上。EOC發(fā)病隱匿、惡性程度較高、生存率較低，是女性生殖系統(tǒng)腫瘤致死率最高的疾病[1]。臨床上，大約有75%的ECO患者到醫(yī)院就診時(shí)已經(jīng)處于Ⅲ期或Ⅳ期，并且5年生存率也僅30%左右[2]。MicroRNA (miRNA)由18～22個(gè)核苷酸組成，是非編碼RNA分子，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[3]。既往有研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中有多種miRNA異常表達(dá)，例如漿液性卵巢癌組織中miRNA-200、miRNA-429、miRNA-7、miRNA-124等。miRNA-124是近年來(lái)研究較多的miRNA之一，其在肝癌、胃癌、大腸癌、口腔癌和宮頸癌中表達(dá)水平下降，發(fā)揮著類似抑癌基因的作用[4-6]。miRNA-124可以調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)，從而對(duì)腫瘤的增值、侵襲起到抑制作用[7]。目前，關(guān)于miRNA-124與EGFR在卵巢癌中表達(dá)的報(bào)道比較少。本研究采用顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization，CISH)技術(shù)檢測(cè)了卵巢癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中miRNA-124的表達(dá)水平，另外采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了EGFR的表達(dá)水平，旨在探討miRNA-124與EGFR在上皮性卵巢癌中表達(dá)的相關(guān)性，以及其與癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料

2016年5月至2018年3月于寧波市鄞州人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的EOC患者60例，均經(jīng)過(guò)術(shù)后病理檢查證實(shí)EOC的診斷。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(The International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)分期：Ⅲ期28例，Ⅳ期32例。ECO患者轉(zhuǎn)移灶均為大網(wǎng)膜或者腹膜轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。患者術(shù)前均未接受過(guò)放、化療和(或)激素治療。

1.2方法

1.2.1 miRNA-124水平的檢測(cè)

采用CISH法檢測(cè)miRNA-124的表達(dá)。組織標(biāo)本采用10%福爾馬林固定、石蠟包埋，切片厚度為4μm。檢測(cè)時(shí)進(jìn)行脫蠟和水化處理，并進(jìn)行檸檬酸鹽抗原修復(fù)，100℃烤箱中孵育10min，隨后使用蛋白酶K(上海翊圣生物科技有限公司，貨號(hào)10401ES60)消化和脫水，雜交過(guò)夜，使用DAB(試劑盒購(gòu)于武漢博士德有限公司，貨號(hào)AR1025)進(jìn)行顯色，再使用蘇木素復(fù)染，最后采用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。miRNA-124陽(yáng)性時(shí)鏡下顯示黃色或棕黃色顆粒樣物質(zhì)。

1.2.2 EGFR蛋白的檢測(cè)

鏈霉素-過(guò)氧化物酶免疫組化法檢測(cè)EGFR蛋白的表達(dá)，試劑盒購(gòu)于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)為WB1210-1。檢測(cè)時(shí)進(jìn)行脫蠟和水化處理，隨后進(jìn)行抗原修復(fù)，每張切片加50μL過(guò)氧化物酶阻斷液(試劑A)，溫室孵育10min，再加50μL非免疫性動(dòng)物血清(試劑B)，溫室孵育15min。之后每張切片加50μL生物素標(biāo)記的二抗(試劑C)，溫室孵育1h，加50μL試劑D，溫室孵育10min，使用DAB進(jìn)行顯色，用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，最后使用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用例(百分比)表示，組間比較采用卡方(χ2)檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman分析，P<0.05為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 EOC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中miRNA-124的表達(dá)

如圖1和表1所示，46(76.67%)例原發(fā)灶中miRNA-124表達(dá)陽(yáng)性，18(30.00%)例轉(zhuǎn)移灶中miRNA-124表達(dá)陽(yáng)性，miRNA-124在原發(fā)灶中的表達(dá)率明顯較轉(zhuǎn)移灶高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中EGFR的的陽(yáng)性表達(dá)率均為100.00%，原發(fā)灶中強(qiáng)陽(yáng)性(+++)表達(dá)率較轉(zhuǎn)移灶低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1和表1。

2.2 miRNA-124表達(dá)與EGFR表達(dá)的相關(guān)性分析

miRNA-124和EGFR在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(P= 0.021)，見(jiàn)表2。

注：A為miRNA-124在EOC原發(fā)灶中的表達(dá)(×200)；B為miRNA-124在EOC轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)(×200)；C為EGFR在EOC原發(fā)灶中的表達(dá)(×200)；D為EGFR在EOC轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)(×200)

圖1 EOC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中miRNA-124的表達(dá)

Fig.1 Expression of miRNA-124 in EOC primary foci and metastatic foci

表2 miRNA-124和EGFR在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)的相關(guān)性[n(%)]

3討論

3.1 miRNA-124的生物學(xué)功能

miRNA在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，并且對(duì)腫瘤的診斷和預(yù)后的判斷也有意義[9]。作為新型的分子標(biāo)志物，miRNA可用于腫瘤的早期診斷，其具有廣闊的應(yīng)用前景[10-11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-124是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中必不可少的miRNA之一[12]，miRNA-124在多種腫瘤組織或外周血中的表達(dá)水平下降，對(duì)細(xì)胞的增值、分化、遷移和侵襲起著重要作用[4-5,13]。舒錦等[14]發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中的miRNA-124表達(dá)水平下降。體外實(shí)驗(yàn)中，miRNA-124 在卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可明顯抑制該細(xì)胞的增殖、 遷移和侵襲，并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

3.2 miRNA-124在卵巢癌組織中的表達(dá)水平及意義

目前，檢測(cè)miRNA的方法主要有miRNA芯片法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和Northern blot技術(shù)等，均有較高的特異度和敏感度，但是它們不能顯示miRNA在組織中的定位。CISH是一種新的組織化學(xué)方法，可以評(píng)估基因的擴(kuò)增水平，并且靈敏度較高。本研究采用CISH技術(shù)，通過(guò)miRNA-124互補(bǔ)的核苷酸探針，顯示出miRNA-124在卵巢癌組織中的位置，對(duì)其進(jìn)行定位觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，46(76.67%)例原發(fā)灶中miRNA-124表達(dá)陽(yáng)性，18(30.00%)例轉(zhuǎn)移灶中miRNA-124表達(dá)陽(yáng)性，miRNA-124在原發(fā)灶中的表達(dá)率明顯較轉(zhuǎn)移灶高(P<0.05)。結(jié)果提示miRNA-124的表達(dá)與EOC的轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，miRNA-124可能對(duì)EOC的轉(zhuǎn)移起到抑制作用。

3.3 miRNA-124對(duì)EGFR的影響及意義

既往研究已證實(shí)，EGFR與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，約70%的EOC有EGFR的表達(dá)[15]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抑制EGFR可以抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移[16]。miRNA被認(rèn)為可以促進(jìn)或抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與EGFR、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和E-cadherin等表達(dá)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-124可以調(diào)控EGFR，從而對(duì)腫瘤的增值、侵襲起到抑制作用[7]。有報(bào)道指出，miRNA-124可以通過(guò)與EGFR mRNA的3個(gè)非保守的區(qū)域結(jié)合，使得AKT和ERK1/2這兩個(gè)EGFR信號(hào)通路的關(guān)鍵分子下調(diào)，在多種人類腫瘤細(xì)胞中引起周期阻滯和細(xì)胞死亡[17]。體外研究中，過(guò)表達(dá)miRNA-124可以激活EGFR-P13K-ATK信號(hào)通路，促進(jìn)癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。本組研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中EGFR的表達(dá)率均為100.00%，原發(fā)灶中強(qiáng)陽(yáng)性(+++)表達(dá)率較轉(zhuǎn)移灶低。并且，miRNA-124和EGFR在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。

綜上，miRNA-124在EOC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)有所差異。miRNA-124可能通過(guò)靶向EGFR調(diào)節(jié)EOC的轉(zhuǎn)移，其可能成為治療EOC潛在靶點(diǎn)，但是具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步體內(nèi)外研究。