楊 巍，李明成

(北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 吉林132013)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是一種較常見的頭頸部惡性腫瘤，嚴(yán)重影響人們的健康和生活[1]。病理分析結(jié)果顯示：含WW結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶(WW domain-containing oxidoreductase，WWOX)在OSCC和口腔黏膜白斑組織中表達(dá)缺失，而在正?？谇火つぶ袆t表達(dá)正常，提示W(wǎng)WOX基因可能與OSCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2]。本課題組前期研究[3]顯示：WWOX基因能夠抑制人OSCC Tca8113細(xì)胞生長，促進(jìn)Tca8113細(xì)胞凋亡并影響細(xì)胞中腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，但其具體機(jī)制尚未明確。本研究利用基因芯片技術(shù)分析人OSCC Tca8113細(xì)胞過表達(dá)WWOX基因的基因表達(dá)譜變化，探討WWOX基因?qū)ca8113細(xì)胞的抑癌作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 Tca8113細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。包含WWOX基因的慢病毒載體pGV287-LV-WWOX由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，其病毒液滴度為1×109TU·mL-1。Agilent RNA 6000 Nano Kit 購自美國Agilent公司，GeneChip 3’IVT Express Kit和GeneChip Hybridization Wash and Stain Kit購自美國Affymetrix公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，Affymetrix人全基因組表達(dá)譜芯片購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，F(xiàn)astQuant RT Kit購自北京生化科技有限公司，兔抗WWOX單抗購自美國Santa公司，SYBR Premix Ex TaqTM為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，小鼠抗GAPDH單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG均購自北京中杉金橋有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 慢病毒載體pGV287-LV-WWOX感染Tca8113細(xì)胞 Tca8113細(xì)胞分為2組，第1組為WWOX基因過表達(dá)組：將處于對數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞制成細(xì)胞密度為5×104mL-1的細(xì)胞懸液，接種于6孔板 中，置于37℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到約60%時(shí)，將攜帶WWOX基因的慢病毒液[感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=8]加入至Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔12 h在熒光顯微鏡下觀察載體上綠色熒光蛋白的表達(dá)，當(dāng)熒光率大于80%時(shí)，將細(xì)胞分成2份，分別接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長滿后用于收集細(xì)胞的總RNA 和蛋白質(zhì)。第2組為對照組：將含有空載體pGV287-LV的慢病毒液(病毒滴度為1×109TU·mL-1，MOI=2)感染Tca8113細(xì)胞，其余處理同第1組。

1.3 RNA提取、質(zhì)檢和基因芯片檢測 采用Trizol法提取2組細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測定260和280 nm處吸光度(A)值，計(jì)算RNA的濃度和純度。所得總RNA經(jīng)Nanodrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100質(zhì)檢，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：Nanodrop2000，A(260)/A(280)為1.7～2.2；Agilent Bioanalyzer 2100，RNA完整數(shù)(RNA Integrity Number，RIN)≥7.0，且28S/18S>0.7。質(zhì)檢合格樣本方可進(jìn)行芯片檢測。質(zhì)檢合格的總RNA樣品采用GeneChip 3’IVT Express Kit，按照說明依次合成cDNA、雙鏈DNA模板和帶生物素標(biāo)記的擴(kuò)增RNA(amplified RNA，aRNA)。將純化的aRNA采用Nanodrop 2000測定濃度并進(jìn)行片段化處理后，與人GeneChip Primeview human(Affymetrix)基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交。雜交完成后，對芯片進(jìn)行洗染。采用GeneChipScanner 3000掃描儀進(jìn)行芯片掃描。采集的數(shù)據(jù)使用在線整合分析軟件IPA(www.ingenuity.com)進(jìn)行生物信息分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) Trizol法分別提取2組細(xì)胞總RNA，采用FastQuant RT Kit 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行qRT-PCR 檢測。采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工技術(shù)有限公司合成。WWOX：F，5′-CCAACCACCCGGCAAAGATA-3′；R：5′-AATGCTGCACGCTACGGAG-3′。絲裂原活化蛋白激酶2(mitogen-activated protein 2 kinase，MAP2K)：F，5′-ACTGACGAGCGGTGGAC-3′：R，5′-GTCGGAAGGTTCTGGA-3′。孤核受體4A1(nuclear receptor subfamily 4 group A member 1，NR4A1)：F，5′-TCATGGACGGCTACACAG-3′；R，5′-GTGGCTGAGGACGAGGATG-3′。雙特異性磷酸酶5(dual specificity phosphatase，DUSP5)：F，5′-TCCTCACCTCGCTACTCG-3′；R，5′-ACATCCACGCAACACTCAG-3′；雙特異性磷酸酶6(dual specificity phosphatase，DUSP 6)：F，5′-GAACTGTGGTGTCTTGGTACATT-3′；R，5′-GTTCATCGACAGATTGAGCTTCT-3′。成纖維生長因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2)：F，5′-GGTGGCTGAAAAACGGGAAG-3′；R，5′-AGATGGGACCACACTTTCCATA-3′。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃、 30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，72℃、15 s，共40個(gè)循環(huán)；熒光信號采集設(shè)在延伸步驟中的72℃。繪制熔解曲線，設(shè)置為60℃、30 s。每組樣本重復(fù)檢測3次，記錄Ct值，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.5 Western blotting法檢測Tca8113細(xì)胞中WWOX蛋白表達(dá) 采用RIPA 裂解液提取WWOX基因過表達(dá)組和對照組細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度后，取50 μg總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜，采用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入兔抗WWOX單抗(1∶200)和小鼠抗GAPDH單抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，采用PBST洗滌3次，每次5 min。再分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG(1∶500)，室溫孵育1 h，ECL法顯影。

1.6 差異基因篩選和分析 根據(jù)WWOX基因過表達(dá)組和對照組的基因芯片檢測數(shù)據(jù)的差異倍數(shù)(fold change,FC)，進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)：|FC|>1.5，且P<0.05。根據(jù)京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和貝爾卡特?cái)?shù)據(jù)庫(BIOCARTA)中所有pathway的基因信息，對篩選出的差異基因進(jìn)行pathway富集分析，所有信號通路使用-Log(P)進(jìn)行排序。

2 結(jié) 果

2.1 2組Tca8113細(xì)胞中WWOX基因的表達(dá) 慢病毒載體感染Tca8113細(xì)胞48 h后，qRT-PCR法檢測結(jié)果顯示：WWOX基因過表達(dá)組WWOX基因mRNA相對表達(dá)水平(1.00±0.04)高于對照組(0.57±0.01)(P<0.05)。免疫印跡檢測結(jié)果顯示：WWOX基因過表達(dá)組檢測到WWOX蛋白的表達(dá)，而對照組WWOX蛋白的表達(dá)條帶不明顯。見圖1。

Lane 1:WWOX over-expression group;Lane 2:Control group.

圖1 慢病毒載體感染后2組Tca8113細(xì)胞中WWOX蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of WWOX protein in Tca8113 cells in two groups after infected with lentiviral plasmid

2.2 2組Tca8113細(xì)胞中MAP2K、NR4A1、DUSP5和DUSP6 mRNA相對表達(dá)水平 WWOX基因過表達(dá)組細(xì)胞中MAP2K(1.01±0.02)、NR4A1(1.04±0.02)、DUSP5(1.42±0.06)和DUSP6(2.05±0.09)mRNA相對表達(dá)水平明顯高于對照組(MAP2K: 0.67±0.01，NR4A1: 0.77±0.03，DUSP5: 1.01±0.01、DUSP6: 1.01±0.03)(P<0.05)，而FGFR2 mRNA相對表達(dá)水平(0.41±0.05)低于對照組(1.02±0.02)(P<0.05)。見圖2。

*P<0.05 vs control group.

Fig.2 Relative mRNA expression levels of differentially expressed genes in cells in two groups

2.3 2組Tca8113細(xì)胞中差異表達(dá)基因 對WWOX基因過表達(dá)組和對照組基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)：|FC|>1.5且P<0.05，結(jié)果顯示：WWOX過表達(dá)后，共有347個(gè)基因在Tca8113細(xì)胞中出現(xiàn)差異表達(dá)，其中表達(dá)上調(diào)基因171個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因176個(gè)。對347個(gè)差異基因進(jìn)行散點(diǎn)分析和聚類分析，見圖3A(插頁三)。散點(diǎn)圖中，2組表達(dá)差異不明顯或表達(dá)無差異的基因位于圖像中心，而表達(dá)差異較大的基因則靠近邊緣。聚類圖展示了所有差異基因的聚集情況，紅色表示差異基因表達(dá)上調(diào)，綠色表示差異基因表達(dá)下調(diào)，黑色表示信號值適中，灰色表示基因的信號值未檢出。見圖3B(插頁三)。

2.4 差異表達(dá)基因pathway分析和蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系 經(jīng)典信號通路中差異表達(dá)基因主要分布于癌癥、P53、MAPK和白細(xì)胞介素(interleukin-2,IL-2)等信號傳導(dǎo)通路上。根據(jù)pathway分析結(jié)果預(yù)測可能與WWOX基因相互作用的基因，繪制基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。見圖4。WWOX基因在癌癥和MAPK信號途徑中與其他基因可能存在相互作用關(guān)系。見圖5。

3 討 論

WWOX基因是位于染色體脆性位點(diǎn)的一個(gè)抑癌基因，在包括OSCC等多種腫瘤中表達(dá)降低或缺失[4-6]。WWOX基因的表達(dá)降低能夠?qū)е履[瘤的發(fā)生發(fā)展；而外源過表達(dá)WWOX基因則能夠明顯抑制腫瘤生長[7-9]。

圖4 Tca8113細(xì)胞中差異基因pathway富集分析圖

Fig.4 Functional pathway analysis diagram of differentially expressed genes in Tca8113 cells

A: KEGG pathway in cancer; B: KEGG MAPK signaling pathway.

Fig.5 Network diagram of WWOX gene and signal pathways

WWOX基因能夠抑制Tca8113細(xì)胞生長，誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡。本研究采用基因芯片技術(shù)檢測了WWOX基因過表達(dá)后Tca8113細(xì)胞中基因的表達(dá)差異以及這些基因涉及的相關(guān)信號通路，并選擇MAPK這一經(jīng)典通路中的5個(gè)基因進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示W(wǎng)WOX基因過表達(dá)后，Tca8113細(xì)胞中共有347個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了變化，其中上調(diào)基因171個(gè)，下調(diào)基因176個(gè)；這些基因分布于P53、MAPK、IL-2以及與癌癥相關(guān)的多條信號通路中。MAPK是一條經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路，廣泛參與細(xì)胞生長、分化和發(fā)育等過程[10]。本研究結(jié)果顯示：在MAPK信號通路中，MAP2K、NR4A1、DUSP5和DUSP6 mRNA表達(dá)水平升高，而FGFR2 mRNA表達(dá)水平降低。NR4A1是核受體超家族的一員，可依賴ERK/MAPK通路以MAP2K5-MAPK7-NR4A1級聯(lián)方式被活化。在OSCC中，活化的NR4A1能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放引起細(xì)胞凋亡[11-12]。而另一研究[13]顯示W(wǎng)WOX基因過表達(dá)同樣能夠誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放。因此本文作者推測：WWOX基因過表達(dá)誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡與調(diào)節(jié)MAP2K和NR4A1的表達(dá)及干擾細(xì)胞色素C的釋放有關(guān)。DUSP5和DUSP6是MAPK磷酸激酶家族一員，是ERK磷酸化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，對腫瘤細(xì)胞生長起到抑制作用[14-15]。而FGFR2則是一種酪氨酸激酶受體，對腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用[16]。本研究結(jié)果顯示：WWOX基因過表達(dá)引起DUSP5和DUSP6 mRNA表達(dá)水平升高和FGFR2 mRNA表達(dá)水平降低。本課題組前期研究[3]顯示：WWOX基因過表達(dá)可抑制Tca8113細(xì)胞的生長，本文作者推測：WWOX基因?qū)ca8113細(xì)胞的抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)DUSP5、DUSP6和FGFR2的表達(dá)，進(jìn)而影響ERK/MAPK信號通路的傳導(dǎo)。

生物信息學(xué)是近年來廣泛應(yīng)用于基因、蛋白質(zhì)、代謝和疾病發(fā)生等多個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究工具。生物信息學(xué)能夠幫助研究者解讀龐大的數(shù)據(jù)，解釋生命或疾病過程中潛在的分子變化，促進(jìn)對復(fù)雜疾病發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識從傳統(tǒng)的生物醫(yī)學(xué)研究逐步轉(zhuǎn)向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究。本研究利用基因芯片技術(shù)檢測了在Tca8113細(xì)胞中過表達(dá)WWOX基因所導(dǎo)致的細(xì)胞基因譜的變化，并對差異基因進(jìn)行了信號通路分析和基因相互作用關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)WWOX基因的抑癌作用與調(diào)節(jié)MAPK通路上的重要蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果為探索WWOX基因的抑癌作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為深入了解WWOX基因的生物學(xué)功能提供了研究方向。