劉林娜，陳婕妤，呂方怡，花扣珍，蔡大敏，銀國利，王俊娟

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325000；2.杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，浙江 杭州310014)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是骨科臨床較常見的疾病[1]，隨著現(xiàn)代社會(huì)交通、建筑事業(yè)的快速發(fā)展，SCI患者日漸增多，目前美國每100萬人口中有906例SCI患者[2]。SCI容易致殘，使患者喪失部分或者全部勞動(dòng)力，給社會(huì)和家庭造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。由于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性再生能力極弱[3]，目前除了SCI 8 h內(nèi)給予大劑量甲基強(qiáng)的松龍對(duì)于治療SCI有一定治療效果外，并無其他更有效的治療辦法。因此針對(duì)SCI繼發(fā)性損傷的機(jī)制探討及探索新的治療方式成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。SCI后會(huì)發(fā)生復(fù)雜的病理變化，如局部組織缺血、水腫引起神經(jīng)元凋亡和壞死，壞死的神經(jīng)元軸突斷裂并發(fā)生脫髓鞘反應(yīng)，同時(shí)在局部形成脊髓空洞[4-5]。局部炎癥反應(yīng)可以刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨?、聚集和增生形成膠質(zhì)瘢痕，形成的膠質(zhì)瘢痕一方面構(gòu)成了神經(jīng)元再生修復(fù)的物理屏障，一方面通過分泌阻礙再生的炎癥因子構(gòu)成了神經(jīng)元再生的化學(xué)屏障[6-7]。因此促進(jìn)神經(jīng)元再生與修復(fù)，減弱脫髓鞘反應(yīng)和局部的膠質(zhì)瘢痕形成可以有效地促進(jìn)SCI的修復(fù)。

芬戈莫德(fingolimod，F(xiàn)TY720)是一種鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑，具有良好的免疫調(diào)節(jié)特性，是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥的口服藥物，其神經(jīng)保護(hù)作用已經(jīng)得到認(rèn)可[6]。研究[7]顯示：FTY720可以有效抑制T細(xì)胞遷移進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，減少病灶處的局部免疫反應(yīng)起到相應(yīng)的治療作用。FTY720是一類親脂小分子,可以輕易穿過血腦屏障[8]，在神經(jīng)元、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells ，NSCs)和星形膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞中也有FTY720受體表達(dá)[9]。實(shí)驗(yàn)[10-12]證實(shí)：對(duì)SCI和阿爾茨海默病等非免疫原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者給予口服FTY720治療能夠明顯改善疾病的預(yù)后，提示FTY720可以通過直接作用于NSCs和星形膠質(zhì)細(xì)胞等起到神經(jīng)保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚未見報(bào)道。開發(fā)一種新型藥物并探討其具體機(jī)制對(duì)于治療SCI具有重大意義，本研究圍繞FTY720作為治療SCI新型藥物的問題，觀察FTY720對(duì)NSCs和星形膠質(zhì)細(xì)胞等增殖及遷移的影響，探討FTY720參與SCI修復(fù)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 25只體質(zhì)量約為25 g的成年C57BL/6雄鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，使用許可證號(hào)：SVXK(浙)2013-0814。FTY720(美國Cayman Chemical公司)，4’6-二脒基-2-苯基吲哚(4’6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(索萊寶科技有限公司)，Nestin和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrill acidic protein,GFAP)(美國Thermo Fisher公司)，TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。BX41光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本Olympus公司)，Leitz 1512 石蠟切片機(jī)(德國Leitz 公司)。

1.2 細(xì)胞的體外分離和分組 取5只出生后24 h內(nèi)的C57BL/6小鼠，酒精消毒后置入D-Hanks’液，洗滌，取其整條脊柱，去除外層肌肉，將剪刀沿脊柱將椎板打開，暴露整個(gè)脊髓，除去脊髓表面結(jié)締組織和血管,分離大鼠脊髓組織。 加入1 mL胰酶消化后加入少量含血清的培養(yǎng)基終止消化，離心5 min。將分離得到的細(xì)胞分別在裝有NSCs和星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將2種細(xì)胞分別隨機(jī)分成對(duì)照組(采用PBS進(jìn)行處理)和實(shí)驗(yàn)組(采用0.1 μmol·L-1FTY720進(jìn)行處理)。

1.3 SCI動(dòng)物模型構(gòu)建 取20只C57BL/6小鼠，確定小鼠體表T10的標(biāo)志，暴露椎板，用咬骨鉗和小鑷子咬去T9棘突，打開椎板，暴露一段5 mm長的脊髓。 采用顯微解剖刀對(duì)準(zhǔn)并避開脊髓后正中動(dòng)脈，貫穿脊髓，向右側(cè)平移至完全橫斷右側(cè)脊髓?？p合軟組織及皮膚。術(shù)后3 d給予抗生素預(yù)防感染常規(guī)排尿護(hù)理。

1.4 動(dòng)物分組和給藥方式 將上述已造模小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。對(duì)照組小鼠口服PBS，實(shí)驗(yàn)組小鼠口服1 mg·kg-1·d-1FTY720，均連續(xù)給藥14 d。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)觀察2組NSCs遷移細(xì)胞數(shù) 當(dāng)培養(yǎng)的NSCs長到約90%時(shí)，吸走培養(yǎng)基后加入適量無菌PBS洗滌2次。加入胰酶消化后加入少量含血清的培養(yǎng)基終止消化，離心5 min。采用移液槍輕輕吹打培養(yǎng)皿底部細(xì)胞，將吹打下的細(xì)胞收集至15 mL離心管中，1 300 r·min-1離心5 min。棄去上清后重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，然后稀釋至5×106mL-1,取0.1 mL細(xì)胞懸液，分別加入Transwell上室，在Transwell下室中加入0.6 mL培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2的環(huán)境中遷移12 h。將Transwell小室膜上下的細(xì)胞采用1×PBS洗滌3次，每次5 min。采用4%多聚甲醛固定15 min。1×PBS洗滌3次，每次5 min。將小室上層細(xì)胞采用醫(yī)用棉簽輕輕擦拭，留下小室下層細(xì)胞DAPI染色后光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的NSCs或者SCI 4周后的脊髓冰凍切片，采用PBS洗滌3次，每次5 min，4%多聚甲醛溶液固定15 min后，PBS洗去多余固定液。采用0.2%Triton X-100透膜5 min，采用PBS洗滌3次，每次5 min。采用5% BSA室溫封閉30 min，采用1%BSA稀釋一抗Nestin或者GFAP，加入稀釋好的一抗，放在濕盒里孵育，4℃過夜。次日，采用PBS洗滌3次，每次5 min。加入1%BSA稀釋的488二抗(山羊抗鼠)避光孵育1 h后，采用PBS洗滌3次。加入DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色5 min，采用PBS洗滌3次，每次5 min。采用免疫熒光封片劑封片，暗盒保存。取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組星形膠質(zhì)細(xì)胞，以與NSCs同樣方式進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)操作。在熒光顯微鏡下觀察NSCs遷移細(xì)胞數(shù)和增殖神經(jīng)球數(shù)以及星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)，體內(nèi)檢測小鼠SCI震中GFAP熒光強(qiáng)度，以此表示星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)。

1.6 HE染色檢測小鼠SCI空洞面積 造模4周后，采用10%水合氯醛麻醉小鼠，剪開右心耳，經(jīng)左心室灌入PBS直到小鼠肝臟變白，然后灌入4%多聚甲醛直到小鼠尾巴翹起變硬。經(jīng)4%多聚甲醛內(nèi)固定后以10%～30%蔗糖梯度脫水。取損傷中心前后約1 cm長(頭尾各50 mm)脊髓組織進(jìn)行連續(xù)冰凍切片，切片厚約20 μm。將切片放置烘箱過夜烘干。蒸餾水滴洗樣本2 min，將樣本放入蘇木素中染色5 min，采用自來水沖洗。迅速插入鹽酸乙醇,分化1 s后拔出。樣本置于自來水中浸泡15 min，伊紅溶液中30 s。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)HE染色后的脊髓切片進(jìn)行照相，采用PS軟件直接測量SCI空洞面積。

1.7 Basso Mouse Scale(BMS)評(píng)分評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)情況 術(shù)后1、2、3、4和5周分別以改良標(biāo)準(zhǔn)BMS評(píng)分法評(píng)估所有小鼠的后肢關(guān)節(jié)活動(dòng)度、協(xié)調(diào)性、腳爪姿態(tài)、軀干穩(wěn)定性及尾巴姿勢等。所有觀察均在上午10：00～12：00進(jìn)行，每次持續(xù)2 min。同時(shí)采用數(shù)碼攝像機(jī)記錄小鼠行為。所有評(píng)分均在單盲情況下進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 2組小鼠NSCs遷移細(xì)胞數(shù) 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組NSCs遷移細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)。DAPI染色結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組NSCs遷移細(xì)胞數(shù)增多，即0.1 μmol·L-1FTY720能促進(jìn)NSCs的遷移。見圖1和2(插頁四)。

*P<0.05 vs control group.

Fig.1 Number of migration cells of NSCs of mice in two groups

2.2 2組小鼠NSCs增殖神經(jīng)球數(shù) 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組NSCs增殖神經(jīng)球數(shù)增多(P<0.05)，形態(tài)較飽滿。 見圖3和4(插頁四)。

2.3 2組小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù) 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，細(xì)胞形態(tài)較癟。見圖5和6(插頁五)。

*P<0.05 vs control group.

Fig.3 Number of proliferative neurospheres of NSCs of mice in two groups

*P<0.05 vs control group.

Fig.5 Number of migration cells of astrocytes of mice in two groups

2.4 2組小鼠SCI震中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù) 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠SCI震中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，細(xì)胞形態(tài)不完整；對(duì)照組小鼠SCI震中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞形態(tài)完整。見圖7和8(插頁五)。

2.5 2組小鼠SCI空洞面積和愈合情況 與對(duì)照組比較，F(xiàn)TY720組小鼠SCI空洞面積縮小(P<0.05)。見圖9和10(插頁五)。

2.6 2組小鼠BMS評(píng)分 隨著時(shí)間的推移，2組小鼠BMS評(píng)分均升高，但實(shí)驗(yàn)組小鼠BMS評(píng)分升高更明顯。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠BMS評(píng)分明顯升高(P<0.05)。見圖11。

*P<0.05 vs control group.

Fig.7 Fluorescence intensities of GFAP in damaged SCI of mice in two groups

*P<0.05 vs control group.

*P<0.05 vs control group.

Fig.11 Diagram of relationship between BMS scores and time of mice in expriment group and control group after SCI

3 討 論

雖然FTY720對(duì)于SCI的保護(hù)作用已有報(bào)道，但是以往的研究[13]結(jié)果顯示：FTY720主要通過抑制T細(xì)胞遷移而減少血液中T細(xì)胞水平，使其停留在淋巴結(jié)中發(fā)揮相應(yīng)的作用。最近有研究[14]顯示:FTY720對(duì)重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠SCI后的神經(jīng)保護(hù)作用與野生型小鼠無異，引起研究者對(duì)于FTY720的再次關(guān)注。本研究結(jié)果顯示:FTY720可以促進(jìn)小鼠SCI后的組織學(xué)修復(fù)和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，該結(jié)果與以往的研究結(jié)果[14]吻合。

星形膠質(zhì)細(xì)胞在SCI損傷過程中扮演了重要的角色，其可以在損傷處大量聚集，分泌抑制神經(jīng)再生的因子，構(gòu)成SCI修復(fù)的物理及化學(xué)屏障[6-7]。因此，有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化和遷移至損傷局部可以有效地促進(jìn)SCI的修復(fù)[14]。本研究采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測了FTY720對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示：FTY720在體外可以顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移；熒光染色結(jié)果顯示：FTY720可以明顯減少星形膠質(zhì)細(xì)胞在SCI震中的聚集，促進(jìn)小鼠SCI后運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)。研究[15]顯示:FTY720對(duì)于敲除了星形膠質(zhì)細(xì)胞表面受體多發(fā)性硬化小鼠治療無效，提示FTY720可能通過作用于星型膠質(zhì)細(xì)胞起到治療多發(fā)性硬化的作用，本研究結(jié)果在體內(nèi)和體外再次驗(yàn)證了FTY720對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用。

NSCs可以分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，可加速神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，同時(shí)改善SCI的局部炎癥，抑制局部炎癥環(huán)境毒性作用，促進(jìn)NSCs在SCI后增殖和遷移至損傷局部以有效地改善SCI后的損傷修復(fù)[16-19]。本研究結(jié)果顯示:FTY720在體外可以明顯促進(jìn)NSCs的增殖和遷移，該結(jié)果再次從非免疫角度闡明了FTY720對(duì)于SCI修復(fù)的可能作用機(jī)制，為FTY720作為治療SCI藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

本研究結(jié)果初步證實(shí)：FTY720可以直接作用于NSCs和星形膠質(zhì)細(xì)胞，影響其增殖或者遷移，從而促進(jìn)SCI的恢復(fù)。本研究結(jié)果初步闡明了FTY720對(duì)于SCI修復(fù)的可能作用機(jī)制，為FTY720作為治療SCI藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。