吳思湟,姜 巧,陳 翹,孫衛(wèi)民,彭 亮

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院,廣州 510182;2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣州 510260; 3.廣東三九腦科醫(yī)院神經(jīng)重癥監(jiān)護(hù)病區(qū),廣州 510510；4.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510700)

24 h尿液生化檢查可獲得反映糖代謝、腎功能、酸堿代謝平衡等指標(biāo)的檢測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)于臨床疾病的診斷和病情的判斷有重要的幫助[1-3]。24 h尿液標(biāo)本的留取，需收集患者24 h內(nèi)的全部尿液。由于時(shí)間較長(zhǎng)，為抑制微生物的生長(zhǎng)、防止葡萄糖的分解，以及保持尿液中待測(cè)物質(zhì)的穩(wěn)定性，通常需要在留取標(biāo)本時(shí)加入防腐劑。

不同項(xiàng)目的檢測(cè)選用的防腐劑不同，如濃鹽酸用于24 h尿液兒茶酚胺、17-羥皮質(zhì)類固醇和17-酮類固醇、鈣、磷等定量測(cè)定；冰乙酸適用于24 h尿液醛固酮測(cè)定；麝香草酚適用于尿液顯微鏡檢查，尤其是尿液濃縮結(jié)核分枝桿菌的檢查；而甲苯適用于尿蛋白等生化項(xiàng)目的測(cè)定[4-6]。由于肌酐、尿素和蛋白質(zhì)等指標(biāo)對(duì)于腎功能判斷尤為重要，目前檢驗(yàn)科常以甲苯作為24 h尿液生化檢查的防腐劑。然而甲苯具有許多缺點(diǎn)，如高度易燃、易揮發(fā)，有刺激性氣味，可經(jīng)吸入、食入及皮膚接觸導(dǎo)致中毒，對(duì)患者及檢驗(yàn)工作者的健康危害較大。另外，甲苯對(duì)生化儀器中的比色杯還具有一定的腐蝕性[7-8]。因此，尋找新的防腐劑替代品是非常有必要的。尼泊金酯系列(主要包括尼泊金甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、庚酯)作為防腐劑多用于食品、醫(yī)藥、化妝等行業(yè)[9]。已有少量研究發(fā)現(xiàn)，尼泊金乙酯的防腐性能較甲苯好，且對(duì)尿液肌酐、尿素、蛋白的測(cè)定沒有影響[3-4]。由于抑菌效果和毒性等性質(zhì)受構(gòu)成R烷基的碳原子數(shù)的影響，隨著碳原子數(shù)的增加，尼泊金酯的抑菌效果越好、毒性越小[10]。而尼泊金丁酯作為防腐劑用于24 h尿液標(biāo)本生化檢測(cè)還未見報(bào)道，且尼泊金酯系列對(duì)于尿液標(biāo)本離子檢測(cè)是否有影響也少有資料可查。故本研究擬將尼泊金丁酯作為防腐劑，分析其對(duì)24 h尿液標(biāo)本中病原菌，以及微量總蛋白、葡萄糖、離子(鉀、鈉、鈣、氯、磷)、肌酐和尿素的影響，探討其作為防腐劑用于部分生化項(xiàng)目測(cè)定的可能性。

1 材料與方法

1.1材料 收集門診或住院部患者的新鮮尿液標(biāo)本共40份(有菌尿和無(wú)菌尿標(biāo)本各20份)。每份標(biāo)本分成4組，包括原始標(biāo)本組、無(wú)防腐劑組、甲苯組、尼泊金丁酯組。

1.2儀器與試劑 采用10%尼泊金丁酯乙醇溶液：稱取100 mg尼泊金丁酯，加入1 mL無(wú)水乙醇中，使其充分溶解。尼泊金丁酯購(gòu)自Target Mol公司。分析純甲苯購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。生化項(xiàng)目檢測(cè)儀器：自動(dòng)生化儀日立7600。

1.3方法

1.2.1標(biāo)本處理及生化檢測(cè) 原始標(biāo)本組：采用全自動(dòng)生化儀日立7600檢測(cè)微量總蛋白、葡萄糖、離子(鉀、鈉、氯、磷、鈣)、肌酐和尿素。無(wú)防腐劑組：不添加任何防腐劑。甲苯組：取10 μL甲苯加入1 mL尿液[11]。尼泊金丁酯組：結(jié)合文獻(xiàn)并進(jìn)行條件優(yōu)化，取5 μL 10%尼泊金丁酯乙醇溶液加入1 mL尿液中，終濃度為0.5 g/L[12-14]。無(wú)防腐劑組、甲苯組、尼泊金丁酯組標(biāo)本常溫放置24 h后參照原始標(biāo)本組方法檢測(cè)。

1.2.2菌量計(jì)數(shù) 4組尿液標(biāo)本均取一定量進(jìn)行梯度稀釋(共8梯度：1∶10-1、1∶10-2、1∶10-3、……、1∶10-8)，在血平板上涂布，待尿液干透后，倒置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)菌(或真菌)的有無(wú)及生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，換算出尿液中的菌含量，并將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為以10為底的對(duì)數(shù)形式。

2 結(jié) 果

2.1尼泊金丁酯對(duì)肌酐、尿素、微量總蛋白檢測(cè)結(jié)果的影響 甲苯組、尼泊金丁酯組及無(wú)防腐劑組標(biāo)本放置24 h后與原始標(biāo)本組比較，肌酐、尿素、微量總蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、2。

2.2尼泊金丁酯對(duì)離子(鉀、鈉、氯、磷、鈣)檢測(cè)結(jié)果的影響 甲苯組、尼泊金丁酯組及無(wú)防腐劑組標(biāo)本放置24 h后與原始標(biāo)本組比較，鉀、鈉、氯、磷、鈣離子的結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3、4。

表1 無(wú)菌尿液標(biāo)本肌酐、尿素、微量蛋白檢測(cè)結(jié)果

注：與原始標(biāo)本組比較，*P>0.05；檢測(cè)結(jié)果以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示

表2 有菌尿液標(biāo)本肌酐、尿素、微量蛋白檢測(cè)結(jié)果

注：與原始標(biāo)本組比較，*P>0.05；檢測(cè)結(jié)果以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示

表3 無(wú)菌尿液標(biāo)本鉀、鈉、氯、磷、鈣離子檢測(cè)結(jié)果

注：與原始標(biāo)本組比較，*P>0.05

表4 有菌尿液標(biāo)本鉀、鈉、氯、磷、鈣離子檢測(cè)結(jié)果

注：與原始標(biāo)本組比較，*P>0.05

2.3尼泊金丁酯對(duì)尿液中病原菌的生長(zhǎng)及葡萄糖分解的影響 有菌尿液標(biāo)本加入尼泊金丁酯后，尿液標(biāo)本中的細(xì)菌含量明顯低于原始標(biāo)本組(P<0.05)。甲苯組和無(wú)防腐劑組的菌量，與原始標(biāo)本組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。無(wú)菌尿液標(biāo)本4組均未見明顯病原菌生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未展示)。另外，無(wú)菌尿液標(biāo)本中由于葡萄糖未受病原菌的分解，24 h后與原始標(biāo)本組葡萄糖水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而有菌尿液標(biāo)本中，甲苯組及無(wú)防腐劑組的尿液放置24 h后，葡萄糖水平較原始標(biāo)本組均明顯降低(P<0.05)；尼泊金丁酯組與原始標(biāo)本組比較，葡萄糖水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。見表5。

表5 有菌尿液標(biāo)本菌落計(jì)數(shù)及有菌、無(wú)菌尿液標(biāo)本中葡萄糖水平檢測(cè)

注：與原始標(biāo)本組比較，*P>0.05，#P<0.05；葡萄糖結(jié)果以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示

3 討 論

尼泊金酯系列作為防腐劑用于檢驗(yàn)的研究目前較少，有研究認(rèn)為尼泊金乙酯用于尿液標(biāo)本的防腐具有效果好、無(wú)毒性、不易揮發(fā)的優(yōu)越性。尼泊金乙酯比甲苯具有更好的抑菌防腐功效；能夠很好地防止尿液中葡萄糖被微生物酵解，同時(shí)不會(huì)干擾尿液中蛋白質(zhì)、尿素、肌酐等化學(xué)成分的測(cè)定[12-13]。尼泊金丁酯的抗菌作用比尼泊金乙酯更強(qiáng)，多作為防腐劑用于食品、化妝品等行業(yè)[10,14]。而其在尿液防腐中的作用國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道，因此本項(xiàng)目對(duì)尼泊金丁酯用于24 h尿液生化標(biāo)本的防腐效果進(jìn)行了研究。

本研究顯示，尼泊金丁酯組的葡萄糖水平與處理前的原始標(biāo)本組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而無(wú)防腐劑組和甲苯組葡萄糖水平與原始標(biāo)本組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明這兩組葡萄糖均有不同程度的分解，主要原因?yàn)槲⑸锏南?、利用。其余生化指?biāo)離子(鉀、鈉、氯、鈣、磷)、肌酐、尿素、微量總蛋白，4組結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。防腐作用方面，對(duì)于有菌尿液標(biāo)本，甲苯組、無(wú)防腐劑組的菌量與原始標(biāo)本組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與鄧敬儀等[15]的研究結(jié)果一致。甲苯作為防腐劑，其原理主要是在標(biāo)本表面形成一層甲苯薄膜，阻止尿液與空氣接觸，達(dá)到防腐效果。但如果標(biāo)本本身已存在大量微生物(如尿路感染患者尿標(biāo)本)，則甲苯對(duì)其抑制作用并不明顯。而尼泊金丁酯組與處理前的菌量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明病原菌生長(zhǎng)受到明顯抑制。

尿液中含有的細(xì)菌等微生物會(huì)消耗尿液中的葡萄糖，加入防腐劑的作用是抑制尿液中病原菌的生長(zhǎng)，從而使葡萄糖不易被分解。尼泊金酯亦稱對(duì)羥基苯甲酸酯,由于它具有酚羥基結(jié)構(gòu),所以抗細(xì)菌性能比苯甲酸、山梨酸都強(qiáng)。其作用機(jī)制是破壞微生物的細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性,并可抑制微生物細(xì)胞的呼吸酶系與電子傳遞酶系的活性。尼泊金酯的抑菌活性主要是分子態(tài)起作用,且其分子內(nèi)的羥基已經(jīng)酯化,不再電離，所以它在pH 3.0～8.0均有很好的抑菌效果。尿液在平常飲食條件下，尿液pH值為4.6～8.0，平均為6.0，在此環(huán)境下，尼泊金丁酯能較好地發(fā)揮其防腐性能。值得注意的是，有研究表明尼泊金丁酯對(duì)于芽孢桿菌的抑制作用較弱[14]。

有文獻(xiàn)指出，對(duì)于24 h尿液標(biāo)本，尿液蛋白、尿素、肌酐和電解質(zhì)在不加防腐劑的情況下并無(wú)明顯影響，不同項(xiàng)目檢測(cè)的標(biāo)本留取是否需要加入防腐劑，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際情況(地域、氣候等)綜合考慮，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的側(cè)重性及目的性選擇更適合的防腐劑[2,15-17]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。尼泊金丁酯作為防腐劑在24 h尿液標(biāo)本生化檢查中，在不影響離子(鉀、鈉、氯、鈣、磷)、 微量總蛋白、肌酐及尿素結(jié)果準(zhǔn)確性的情況下，對(duì)病原菌有較強(qiáng)的抑制能力，可有效防止菌尿標(biāo)本中葡萄糖的分解，減小該指標(biāo)檢測(cè)的誤差。需要提出的是，24 h尿液葡萄糖檢測(cè)在腎功能判斷中的價(jià)值存在一定局限性。因此，后續(xù)研究可進(jìn)一步觀察尼泊金丁酯對(duì)24 h尿液其他項(xiàng)目檢測(cè)的影響。另外，如何促進(jìn)尼泊金丁酯在尿液標(biāo)本中的溶解度也值得繼續(xù)探索。