蘇星予，廖 昂，鄧啟明，肖成琴，劉 芹

(重慶市永川區(qū)婦幼保健院檢驗科 402160)

宮頸癌是一種婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，位居全球第2位[1-2]。2012年全球約52.8萬例宮頸癌患者，約26.6萬例患者因?qū)m頸癌而死亡[3-4]。同年，國內(nèi)有61 691例新發(fā)宮頸癌病例，是全球范圍的12%，有29 526例宮頸癌死亡病例，是全球范圍的11%[5]。2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國宮頸癌的發(fā)病率在全球?qū)m頸癌發(fā)病率中高居第2位[6]。目前，國人對人乳頭瘤病毒(HPV)感染及其相關(guān)疾病與疫苗的認知情況因性別、民族和受教育程度等因素影響存在較大差異，大眾普遍認知較低[3]。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，HPV感染是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的必要非充分的因素，其感染通常表現(xiàn)為瞬時感染，且具有年齡差異[7-11]。目前，高危型HPV在宮頸癌病因?qū)W中的作用已得到廣泛的研究[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性感染高危型HPV是影響宮頸癌前病變及浸潤性宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的一個重要危險因素[8]?，F(xiàn)已公認至少有12種高危型HPV，分別為HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58和HPV59型[3]。其中，HPV16、HPV18型與宮頸癌關(guān)系最為密切，是全球最主要的致癌性基因型[8,15]，但不同地區(qū)的主要致癌性HPV基因型存在地域差異，在中國、韓國和日本這些東亞國家，HPV58型在浸潤性宮頸癌中更為常見[16]。

由于有效的大規(guī)模宮頸癌篩查，宮頸癌的發(fā)病率近年來明顯降低[1,17]。HPV檢測正在成為宮頸癌篩查的一個重要組成部分[12]。因此，檢測并了解中國女性HPV的感染分布情況，將有助于我國宮頸癌防治工作的開展。本文通過對重慶市永川區(qū)7 500例農(nóng)村女性HPV感染情況進行分析，為本區(qū)HPV感染的流行病學研究及疫苗研制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取重慶市永川區(qū)農(nóng)村戶口7 500例女性為研究對象，年齡35～65歲。其中，35～45歲2 605例，46～55歲3 299例，56～65歲1 596例。由本區(qū)婦幼保健院、金龍衛(wèi)生院、朱沱衛(wèi)生院、臨江衛(wèi)生院、陳食衛(wèi)生院、板橋衛(wèi)生院、仙龍衛(wèi)生院、雙石衛(wèi)生院協(xié)助收集標本。每位受試者均了解本研究內(nèi)容，經(jīng)受試者同意后，由醫(yī)師采集標本送檢。

1.2儀器與試劑 HEMA 9600 PCR擴增儀購于珠海黑馬儀器有限公司，YN-H18全自動核酸分子雜交儀購于深圳亞能生物技術(shù)有限公司，宮頸脫落細胞采集器購于深圳亞能生物技術(shù)有限公司，HPV基因分型檢測試劑盒(15型)購于深圳亞能生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1標本采集方法 以窺陰器暴露宮頸，用棉拭子擦去宮頸口過多的分泌物，按宮頸脫落細胞采集器說明書，使用宮頸刷于宮頸口單方向旋轉(zhuǎn)4～5周以獲取足量的宮頸脫落細胞，并立即置于洗脫管中保存，做好標識后送檢。

1.3.2DNA提取 充分洗脫宮頸刷，轉(zhuǎn)移0.5 mL洗脫液于1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入100 μL裂解液懸浮沉淀，金屬浴加熱10 min后13 000 r/min離心10 min，保留上清液備用。

1.3.3PCR擴增 取出PCR反應液，低速離心數(shù)秒，加入5 μL已提取的待測標本DNA，使總反應體系為25 μL，再次低速離心數(shù)秒后，按以下條件擴增：50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，42 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次；72 ℃ 5 min。

1.3.4雜交 參照標本數(shù)量，在全自動核酸分子雜交儀中放入相應數(shù)量的塑料三聯(lián)雜交盒，并加入足量的純水、A液、B液和C液。用干凈手套取出膜條，按順序編號后放入雜交盒中，由儀器自動加入A液，待儀器工作溫度達到雜交溫度后，加入已變性PCR產(chǎn)物標本雜交30 min。

1.3.5洗膜與顯色 B液洗膜時，按孵育液配制表，在孵育盒中加入定量POD液體，儀器自動導入相應量A液。待B液洗膜10 min后，儀器自動加入POD孵育液孵育15 min。A液洗膜5 min，C液洗膜2 min后，按顯色液配制表，于顯色盒中配制足量的顯色液，由儀器自動加入顯色液。顯色15 min，純水清洗3 min后，即可進行結(jié)果判讀。

1.3.6結(jié)果判讀 根據(jù)膜條上藍色斑點顯現(xiàn)的位置，讀取相應位置上標注的基因型信息，若僅一個基因型位點出現(xiàn)藍色斑點，即為相應基因型的單一感染，若多個基因型位點出現(xiàn)藍色斑點，即為相應基因型的混合感染。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以n或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1各年齡段HPV感染率分析 在7 500例受檢標本中，檢出973例陽性標本，總感染率為12.97%。其中，35～45歲年齡組，2 605例受檢，294例陽性，感染率為11.29%；46～55歲年齡組，3 299例受檢，409例陽性，感染率為12.40%；56～65歲年齡組，1 596例受檢，270例陽性，感染率為16.92%。3組中，56～65歲年齡組感染率最高，與35～45年齡組、46～55年齡組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各年齡段HPV感染率分析

2.2HPV感染亞型分布情況 35～45歲年齡組，主要感染的型別以52型為主，其次為58型和16型，45型感染者最少；46～55歲年齡組，主要感染的型別以52型為主，其次為58型，11型感染者最少；56～65歲年齡組情況與46～55歲年齡組相似，主要感染的型別以52型為主，其次為58型，11型感染者最少。在所檢的7 500例標本中，低危型感染以6型為主，其感染率約為0.44%(33/7 500)；高危型感染以52型感染為主，其感染率約為4.16%(312/7 500)，其次為58型，其感染率約為2.05%(154/7 500)，第3位為16型，其感染率約為1.52%(114/7 500)，第4位為51型，其感染率約為1.33%(100/7 500)，第5位為68型，其感染率約為1.28%(96/7 500)。多重感染型無重復計算。見表2。

表2 HPV感染亞型分布情況

續(xù)表2 HPV感染亞型分布情況

2.3HPV多重感染情況 在7 500例受檢者中，HPV感染存在單一感染、二重感染、三重感染、四重感染、五重感染和七重感染6種情況，未發(fā)現(xiàn)六重感染情況。以單一感染為主，其感染率約為10.11%(758/7 500)；其次為二重感染，其感染率約為2.09%(157/7 500)。見表3。

表3 HPV多重感染情況

2.4HPV二重感染分布情況 在157個HPV二重感染者中，二重感染型別共有60種，以52型復合58型感染為主，感染率為0.13%(10/7 500)，其次為51型復合52型感染與52型復合68型感染，感染率為0.12%(9/7 500)，再次為16型復合52型感染、18型復合52型感染，以及18型復合58型感染，感染率為0.09%(7/7 500)。見表4。

表4 HPV二重感染分布特征

續(xù)表4 HPV二重感染分布特征

3 討 論

宮頸癌是一種常見的女性惡性腫瘤，嚴重威脅著全球女性的健康[9]。相關(guān)資料顯示，在宮頸癌標本中，幾乎均能檢測到HPV的存在，而持續(xù)性高危HPV感染已被認為是引發(fā)宮頸癌的主要致病因素[1,9,18]。通常，從HPV感染、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)、原位癌、早期浸潤癌直至浸潤癌，期間需要經(jīng)歷10年左右的時間[19]。因此，早期進行宮頸HPV篩查，可有效降低宮頸癌的發(fā)病風險，對防治宮頸癌具有重要意義[2,9,20-21]。

國內(nèi)相關(guān)報道顯示，我國HPV總體感染率約為25.0%，但各地區(qū)存在一定差異，其中，我國華東地區(qū)HPV感染率約為31.3%，東北地區(qū)HPV感染率約為34.6%，西北地區(qū)HPV感染率約為23.2%，西南地區(qū)HPV感染率約為24.1%[22]。為了解本區(qū)農(nóng)村女性HPV的感染情況，本文對7 500例農(nóng)村女性進行HPV檢測，其HPV總感染率約為12.97%，明顯低于文獻報道的西南地區(qū)24.1%的感染率，考慮本文研究對象為篩查體檢人群，而非醫(yī)院門診患者，這一結(jié)果提示不同研究人群可能由于其相應的HPV感染危險因素存在差異進而影響其HPV感染率。因此，我們將在今后的工作中深入研究本地區(qū)各人群HPV感染危險因素的情況，以期為進一步提升和改善本區(qū)HPV的防治工作提供基礎(chǔ)。

本文中，本區(qū)35～65歲年齡段的HPV感染率隨年齡呈現(xiàn)上升的趨勢，與本地相關(guān)文獻報道部分相符[23-24]。其中，35～45歲年齡組感染率為11.29%；46～55歲年齡組感染率為12.40%；56～65歲年齡組感染率為16.92%。3組中，56～65歲年齡組感染率最高，且與其他組相比差異有統(tǒng)計學意義。這表明在本區(qū)農(nóng)村女性中，HPV感染存在一定的年齡差異，且中年女性的HPV感染率較高。

本文7 500例受檢標本中，HPV感染以單一感染為主，其感染率約為10.11%(758/7 500)，說明本區(qū)HPV單一型感染較為常見，與本區(qū)其他報道相符[25-26]；其次為二重感染，其感染率約為2.09%(157/7 500)。在二重感染中，共有60種復合型別，以52型復合58型感染為主，感染率為0.13%(10/7 500)，其次為51型復合52型感染與52型復合68型感染，感染率為0.12%(9/7 500)，再次為16型復合52型感染、18型復合52型感染以及18型復合58型感染，感染率為0.09%(7/7 500)。隨著感染型別的增加，其感染率也隨之降低，七重感染僅檢出1例，但此次并未發(fā)現(xiàn)六重感染者。有研究認為，高危型HPV多重感染可能更易導致宮頸瘤變的發(fā)生，因此我們除了重點關(guān)注高危HPV單一感染外，也需要對HPV多重感染引起一定的重視[27]。將單一感染和多重感染合計分析，發(fā)現(xiàn)本區(qū)HPV主要感染型別有HPV16、HPV52和HPV58，與本區(qū)部分報道中的前3位主要感染型別一致[26-28]，但HPV感染型別的排序不同，本文HPV感染型別按感染率高低排序依次為HPV52、HPV58和HPV16。該差異構(gòu)成了本區(qū)農(nóng)村女性HPV單一亞型感染的流行特征，進一步說明HPV感染亞型分布存在地域差異。

有報道顯示，針對性的疫苗可有效防止相應型別的HPV感染，如對HPV16和18型的疫苗可以有效地防止HPV16型和18型感染，從而降低宮頸癌的發(fā)病率，表明不同地區(qū)針對當?shù)豀PV感染特征制訂相應的防治措施十分必要[29-31]。而本區(qū)農(nóng)村女性HPV感染獨特的亞型分布特征，提示針對HPV16、HPV52和HPV58型的疫苗可能更適合本區(qū)農(nóng)村女性。但為了更加全面地了解重慶地區(qū)女性HPV的感染現(xiàn)狀，進一步改善宮頸癌的防治工作，還需要擴大研究人群及樣本量，并對其相應的HPV感染危險因素進行深入、全面、系統(tǒng)的研究。