王子朝， 朱 莉， 吳劍榮， 鄭志永， 高敏杰， 詹曉北*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫214125）

黃原膠的安全性已得到FDA和WHO認(rèn)可。同時，黃原膠良好的穩(wěn)定性、乳化性、懸浮性、增稠性和假塑性使其在食品、醫(yī)藥、日用化工、紡織和石油開采等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1-6]。黃原膠生產(chǎn)一般采用價格低廉的玉米淀粉作碳源，實驗室規(guī)模生產(chǎn)和研究也可用蔗糖和葡萄糖。隨著糧食價格不斷攀升和全球人口不斷增加，國內(nèi)外許多學(xué)者都在研究采用一些工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品副產(chǎn)物來代替玉米淀粉實現(xiàn)黃原膠工業(yè)生產(chǎn)，如木糖、甘蔗糖漿、甜菜糖漿、乳清和脂肪酸等[7]。如果微生物可以利用甘油實現(xiàn)黃原膠工業(yè)生產(chǎn)，不僅可以緩解生物柴油副產(chǎn)物過剩和全球糧食短缺雙重危機(jī)，還可以降低黃原膠生產(chǎn)成本。作者采用馴化得到了一株可以利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠的野油菜黃單胞菌突變株，其生產(chǎn)的黃原膠與商品黃原膠相比，具有粘度低、透明性高、水化速率快和反復(fù)凍融處理后粘度增大的特點。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基組成

X.campestris NRRL B-1459：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。X.campestris WXLB-006經(jīng)馴化得到并保藏于本研究室。

X.campestris NRRL B-1459種子培養(yǎng)基組成（g/L）：蔗糖 20.0，魚粉蛋白胨 5.0，牛肉浸膏 3.0，酵母浸膏 1.0，pH 7.0。

X.campestris WXLB-006種子培養(yǎng)基與X.campestris NRRL B-1459基本一致，用100 g/L甘油替代蔗糖。

馴化培養(yǎng)基：馴化培養(yǎng)基初始組成為X.campestris NRRL B-1459種子培養(yǎng)基。隨著馴化過程進(jìn)行，甘油質(zhì)量濃度逐漸增加，蔗糖質(zhì)量濃度逐漸降低，培養(yǎng)基中其它成分不變。

平板篩選培養(yǎng)基是在馴化培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加20 g/L瓊脂。

分批發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 40（或甘油 100），魚粉蛋白胨 1.5， 酵母浸膏 1.0，NaNO31.0，NH4Cl 1.0，MgSO42.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，K2HPO43.5，KH2PO42.0，pH 7.0。

補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘油 40，其余成分與分批發(fā)酵培養(yǎng)基相同。

1.2 培養(yǎng)條件

1.2.1 種子培養(yǎng) 500 mL三角瓶裝液量50 mL，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。

1.2.2 分批發(fā)酵 500 mL三角瓶裝液量50 mL，培養(yǎng)溫度30℃，接種體積分?jǐn)?shù)10%，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。

1.2.3 補(bǔ)料發(fā)酵 7 L發(fā)酵罐（LiFlus GM BioTRON公司產(chǎn)品）裝液量3 L，接種體積分?jǐn)?shù)10%，培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵過程中用3 mol/L KOH和3 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH維持在7.0。發(fā)酵0～24 h，通氣量0.5 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速 200 r/min；24～60 h，通氣量 1.0 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min。 甘油流加策略：24～34 h，3 g/L/h；34～44 h，2 g/L/h；44～54 h，1 g/L/h。

1.3 材料與試劑

商品黃原膠（食品級）：購于山東淄博中軒生化有限公司；蔗糖、HCl、KOH、魚粉蛋白胨和 NaNO3等試劑：購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Trizol RNA提取試劑盒和第一條鏈cDNA合成試劑盒等：購于生工生物工程（上海）有限公司。

1.4 馴化過程

將X.campestris NRRL B-1459培養(yǎng)在種子培養(yǎng)基中，當(dāng)菌體生長進(jìn)入對數(shù)期，按體積分?jǐn)?shù)10%接種量接入含有15 g/L蔗糖和5 g/L甘油種子培養(yǎng)基中，然后按同樣接種量在此培養(yǎng)基中連續(xù)傳代10次后，取1 mL對數(shù)生長期種子液適當(dāng)稀釋后涂布到相應(yīng)含有15 g/L蔗糖和5 g/L甘油平板篩選培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌體長出來之后，挑取大、透明且凸起的單菌落接種到含有10 g/L蔗糖和10 g/L甘油種子培養(yǎng)基中進(jìn)行下一輪馴化、篩選。在接下來連續(xù)馴化和篩選過程中，蔗糖質(zhì)量濃度逐漸降為0 g/L，而甘油質(zhì)量濃度則逐漸增加至100 g/L。

1.5 多糖樣品的提取與純化

發(fā)酵結(jié)束后，向發(fā)酵液中加入3倍體積去離子水進(jìn)行稀釋，然后20 000 g離心30 min除菌體。向離心得到的上清中加入3倍體積無水乙醇沉淀多糖，40℃、0.1 MPa下干燥48 h得到多糖樣品。

1.6 分析方法

紫外可見分光光度計于600 nm下測量菌懸液吸光度并折算為菌體干質(zhì)量；蔗糖和甘油濃度測定采用高效液相色譜法；多糖用2 mol/L三氟乙酸水解后采用Dionex離子色譜儀進(jìn)行單糖組分測定；多糖樣品與溴化鉀充分研磨壓片后，采用Nexus 470紅外光譜儀在400～4000 cm-1內(nèi)對多糖進(jìn)行紅外掃描；用Agilent 800 MHz核磁共振儀對多糖進(jìn)行核磁分析，以D2O作內(nèi)標(biāo)物；采用高效體積排阻色譜測定多糖相對分子質(zhì)量；采用安東帕Physica MCR301高級旋轉(zhuǎn)流變儀測量1.0 g/dL多糖溶液流變學(xué)特性，測量溫度25℃[8]。

1.7 RT-PCR分析

將生長進(jìn)入指數(shù)后期的X.campestris NRRL B-1459和X.campestrisWXLB-006用去離子水洗滌并離心收集，然后采用Trizol RNA試劑盒提取總RNA，并用第一條鏈cDNA合成試劑盒合成第一條鏈的cDNA，按試劑盒操作方法進(jìn)行提取和合成。以16s rRNA作為內(nèi)參基因且每個樣品的RT-PCR過程均重復(fù)3次，最終實驗結(jié)果為3次結(jié)果平均值。PCR擴(kuò)增采用40個循環(huán)，每個循環(huán)依次為：94℃30 s、51 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s；40個循環(huán)之后 72 ℃處理10 min以終止反應(yīng)并建立PCR產(chǎn)物溶解曲線。采用LightCycler（version 3.3）軟件分析計算目的基因相對表達(dá)量。根據(jù)NCBI中X.campestris ATCC 33913基因序列，使用Premier 5.0軟件設(shè)計目的基因上下游引物用于RT-PCR，引物序列見表1，并由生工生物工程（上海）有限公司合成引物。

表1 RT-PCR引物和引物序列Table 1 Primers and relevant sequences used for RT-PCR

1.8 黃原膠的水化速率測定

兩種黃原膠樣品分別加入去離子水、pH 5.5水溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%NaCl溶液和1.0%蔗糖溶液中測量其在不同溶液中水化速率，黃原膠樣品一次性加入并使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%。磁力攪拌上25℃、300 r/min攪拌溶解。溶解過程中固定時間間隔用Brookfield DV-II粘度計25℃、3號轉(zhuǎn)子、6 r/min測量各溶液粘度。

1.9 反復(fù)凍融對膠溶液粘度的影響

質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%新型黃原膠和商品黃原膠溶液在-20℃冰箱中保存24 h，然后于室溫下放置24 h。重復(fù)此凍融過程5次，每次均用Brookfield DV-II粘度計25℃、3號轉(zhuǎn)子、6 r/min測定各溶液粘度。

1.10 透射電子顯微鏡觀察

將-20℃凍融處理前后的新型黃原膠溶液采用日立H-7650透射電子掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 X.campestris NRRL B-1459和X.campestris WXLB-006發(fā)酵性能對比

通過基因改造可以提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量，但轉(zhuǎn)基因技術(shù)的潛在危害一直受到人們質(zhì)疑，尤其在食品領(lǐng)域[9]。馴化是以達(dá)爾文進(jìn)化論為基礎(chǔ)的自然選擇過程，其安全性相對較高[10]。馴化得到的突變株X.campestris WXLB-006，其菌體生長時間（24 h）、發(fā)酵周期 （60 h）、 生物量 （1.65 g/L） 和黃原膠產(chǎn)量（23.5 g/L）與原始菌株X.campestris NRRL B-1459基本一樣（圖 1（a）和（b））。 馴化效果可以從圖 1（c）和（d）看出，X.campestris NRRL B-1459 不能在 100 g/L甘油培養(yǎng)基中生長；而X.campestris WXLB-006可以利用100 g/L甘油生長并合成黃原膠，且搖瓶中黃原膠產(chǎn)量達(dá)到17.8 g/L。

許多學(xué)者通過馴化得到了類似結(jié)果，Kalogiannis等[11]采用200 g/L甜菜糖蜜對X.campestris ATCC 1395馴化5輪后使黃原膠產(chǎn)量達(dá)到40.5 g/L。Wang et al.[12]在含有醋酸培養(yǎng)基上對Aureobasidium pullulans CCTCC M2012259連續(xù)馴化20輪之后，分離得到一株突變株A.pullulans ARH-1。與原始菌株相比，突變株利用稻殼水解液發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的產(chǎn)量由15.6 g/L增加到22.2 g/L，發(fā)酵周期由60 h縮短至48 h。

2.2 黃原膠性能對比

通過單糖組成分析發(fā)現(xiàn)，新型黃原膠中只含有葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，且3種單糖摩爾比為葡萄糖：甘露糖：葡糖糖醛酸=2.0：1.63：1.0，這與商品黃原膠比較相近（2.0：1.85：1.0）。 此外，新型黃原膠的紅外和核磁共振圖譜與商品黃原膠相吻合（圖未給出），進(jìn)一步說明其是黃原膠。這也與Sutherland[13]報道一致，即野油菜黃單胞菌只能產(chǎn)生黃原膠唯一一種胞外多糖。

圖1 X.campestris NRRL B-1459和X.campestris WXLB-006利用40 g/L蔗糖和100 g/L甘油搖瓶發(fā)酵結(jié)果Fig.1 Flask culture profiles of X.campestris NRRL B-1459 and X.campestris WXLB-006 with 40 g/L sucrose and 100 g/L glycerol as carbon sources

新型黃原膠相對分子質(zhì)量（3.0×106）僅為商品黃原膠（5.8×106）一半左右，且其水溶液粘度低于商品黃原膠。低粘度黃原膠在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域比較受歡迎，雖然可以采用物理、化學(xué)或者酶等方法降低黃原膠粘度[14]，但是通過發(fā)酵直接得到這一低粘度黃原膠，不僅可以省去黃原膠在處理過程中能耗，還可以提高產(chǎn)品安全性。

2.3 RT-PCR

通過RT-PCR對兩株菌中甘油代謝相關(guān)基因相 對轉(zhuǎn)錄水平 分 析 發(fā) 現(xiàn) （圖 2），X.campestris WXLB-006中甘油通道蛋白、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶和果糖-1，6-二磷酸醛縮酶基因的相對表達(dá)量均高于原始菌株，依次為：glpD （8.53）＞glpF（7.64） ＞ glpK （6.61） ＞ fbp （5.79）， 說 明 X.campestris WXLB-006可以利用甘油生長并合成黃原膠的原因與其體內(nèi)甘油代謝相關(guān)基因的激活有關(guān)。圖1（d）中甘油做碳源時黃原膠產(chǎn)量（17.8 g/L）、底物轉(zhuǎn)化率（25%）和發(fā)酵周期（120 h）均不如以蔗糖做碳源時發(fā)酵結(jié)果（圖 1（a）和（b））。 合成黃原膠的前體物質(zhì)是六碳單元（UDP-葡萄糖，GDP-甘露糖和UDP-葡萄糖醛酸），蔗糖主要通過ED途徑為黃原膠合成提供前體物質(zhì)[5]，而甘油在合成黃原膠前體物質(zhì)時糖異生是必經(jīng)途徑[15]，這可能是導(dǎo)致甘油做碳源時黃原膠產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率均較低的原因。其他學(xué)者在以甘油為碳源進(jìn)行不同產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)時遇到了同樣發(fā)酵周期長和底物轉(zhuǎn)化率低的問題[16-17]。

2.4 補(bǔ)料發(fā)酵

X.campestris WXLB-006可以利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)一種新型黃原膠，但發(fā)酵周期長和底物轉(zhuǎn)化率低限制了其工業(yè)應(yīng)用。高攪拌轉(zhuǎn)速引起的剪切力會對菌體造成機(jī)械損傷[18-19]；同時，高底物質(zhì)量濃度不僅抑制野油菜黃單胞菌生長[20]，還會造成碳溢流[21]。所以，作者選擇初始甘油質(zhì)量濃度40 g/L，甘油流加策略為：24～34 h，3 g/L/h；34～44 h，2 g/L/h；44～54 h，1 g/L/h。在菌體生長階段 （0～24 h）采用0.5 vvm和200 r/min，24～60 h 采用 1.0 vvm 和 400 r/min。

由圖3可以看出，菌體生長階段采用低通氣量和低攪拌轉(zhuǎn)速，X.campestris WXLB-006生物量由1.65 g/L增加到1.94 g/L，生物量的提高可以增加黃原膠產(chǎn)量。黃原膠合成屬于GadenⅡ型，即菌體進(jìn)入穩(wěn)定期之后開始合成黃原膠，但隨著黃原膠合成并在發(fā)酵液中積累，發(fā)酵液的傳氧和傳質(zhì)受到限制。因此，發(fā)酵中后期采用高通氣量和高攪拌轉(zhuǎn)速提高發(fā)酵體系的傳氧和傳質(zhì)可以提高黃原膠產(chǎn)量。同時，變速流加甘油策略可以減少碳溢流而進(jìn)一步提高黃原膠產(chǎn)量。通過以上策略，黃原膠產(chǎn)量由17.8 g/L提高到33.9 g/L，發(fā)酵周期由120 h縮短至60 h（圖3）。發(fā)酵前期低通氣量和低攪拌轉(zhuǎn)速還可以降低由高通氣量和高攪拌轉(zhuǎn)速所引起的泡沫而導(dǎo)致的染菌率。

圖2 兩株菌中甘油代謝途徑相關(guān)基因的相對轉(zhuǎn)率水平Fig.2 Relative transcription level of glycerol metabolism related genes in two strains

圖3 X.campestris WXLB-006采用變通氣量和變攪拌轉(zhuǎn)速補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果Fig.3 Time courses of X.campestris WXLB-006 with variable aeration rate and stirring speed in fedbatch fermentation

2.5 水化速率

當(dāng)前，黃原膠以其在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%KCl溶液中粘度進(jìn)行分級，但這種分級方法忽視了黃原膠的一些實際應(yīng)用（如透明性和水化速率）。商品黃原膠在去離子水中攪拌溶解60 min后達(dá)到其飽和粘度（圖 4（a）），而新型黃原膠僅需 20 min（圖 4（b）），這一時間為商品黃原膠三分之一。

圖4 商品黃原膠和新型黃原膠水化速率Fig.4 Hydration rate of commercial xanthan and new xanthan

雖然蔗糖、NaCl和弱酸對兩種黃原膠的水化時間均有延長 （商品黃原膠從60 min增加到90 min；新型黃原膠從20 min增加到30 min），但是新型黃原膠的水化速率仍快于商品黃原膠。新型黃原膠快速水化的特性，不僅可以減少在攪拌溶解過程中空氣的裹入，還可以降低攪拌設(shè)備投入，將其應(yīng)用到速溶類食品中效果極佳。

2.6 反復(fù)凍融

很多食品都會選擇添加一定量增稠劑、乳化劑或穩(wěn)定劑等，這些食品在食用之前會因其中添加成分在冷凍條件下流變學(xué)性質(zhì)的改變而發(fā)生形變，進(jìn)而影響其外形和口感[22]。圖5（a）中，商品黃原膠粘度幾乎不受-20℃反復(fù)凍融影響，始終維持在11 500 mPa·s左右；但新型黃原膠粘度隨凍融次數(shù)增加而逐漸增大，從初始 1 100 mPa·s增大到 1 850 mPa·s，且凍融處理3次以后，粘度基本穩(wěn)定在1 850 mPa·s。

圖5 冷凍對商品黃原膠和新型黃原膠粘度影響Fig.5 Refrigerated storage on the viscosity of commercial and new xanthan

通過透射電鏡對凍融前后新型黃原膠溶液觀察發(fā)現(xiàn)（圖6），反復(fù)凍融使新型黃原膠在溶液中發(fā)生聚集，具體原因還有待進(jìn)一步研究。新型黃原膠溶液凍融處理后粘度增大的特性使其應(yīng)用到食品中意義重大。首先，復(fù)配使用時可以彌補(bǔ)其它增稠劑在凍融處理中粘度降低的不足，維持產(chǎn)品形態(tài)；其次，可以減少肉制品在凍融過程中肉汁流失，提高肉制品色澤和品質(zhì)；最后，在冷鏈運(yùn)輸過程中，可以減少冰晶對產(chǎn)品結(jié)構(gòu)破壞，提高產(chǎn)品品質(zhì)并延長貨架期[23]。

圖6 凍融前后新型黃原膠溶液透射電鏡圖Fig.6 TEM images of new xanthan solutions before and after freeze-thaw

3 結(jié) 語

通過馴化得到了一株可以利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠的野油菜黃單胞菌突變株。RT-PCR結(jié)果顯示突變株中甘油代謝相關(guān)基因的相對表達(dá)量均明顯高于出發(fā)菌株。采用不同發(fā)酵策略使黃原膠產(chǎn)量達(dá)到33.9 g/L，發(fā)酵周期縮短至60 h，且發(fā)酵得到的黃原膠具有粘度低、透明性高、水化速率快和凍融處理后粘度增大的特性。