游 霞， 劉彩紅， 崔步云， 李雅琪， 韋鳳杰， 吳鳴建*

（1.鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南煙草公司，河南 鄭州 450002）

關(guān)鍵字：煙草廢棄物；淀粉酶；美拉德反應(yīng)；GC-MS分析

中國煙草的種植面積和產(chǎn)量均居世界前列，但其中20%～30%煙葉是不能用作卷煙原料的，這不僅浪費(fèi)資源，還污染環(huán)境，因此合理綜合利用煙草廢棄物變得尤為重要[1]。

美拉德反應(yīng)又稱為非酶棕色化反應(yīng)，主要是氨基化合物與羰基化合物之間的復(fù)雜反應(yīng)，美拉德反應(yīng)會產(chǎn)生很多致香物質(zhì)，其中大部分也是煙草中重要的香味成分。目前對煙草廢棄物的綜合利用主要是從中提取茄尼醇、煙堿、蛋白質(zhì)、果膠、煙酰胺和黃酮類等物質(zhì)，但附加值較低。煙草中水溶性糖中還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)25%，非還原糖可達(dá)5%；不溶性的多糖中淀粉和果膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)8%，在酶的作用下水解為單糖，即能為美拉德反應(yīng)提供足夠的碳源[2-10]。

利用美拉德反應(yīng)制備的煙用香精，因其具有天然、健康和安全的特性而倍受青睞[11]，大部分研究主要集中在以單糖和氨基酸為原料來來研究美拉德反應(yīng)[12]，而以煙草廢棄物為原料的研究較少。作者是以煙草廢棄物為原料來制備美拉德煙用香精，作者以α-淀粉酶和β-淀粉酶的復(fù)合酶處理煙草廢棄物，以復(fù)合酶解液為主要碳源，外加氨基酸為氮源，通過美拉德反應(yīng)制備煙用香精；采用GC-MS分析美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)成分，并評價(jià)其感官效果，以期為煙用香精的制備和煙草廢棄物的利用化提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

煙草廢棄物：由河南省平頂山煙葉示范田提供，50℃烘干，粉碎，過80目篩；α-淀粉酶和β-淀粉酶：南寧龐博生物工程有限公司提供；其他試劑均為分析純。

FW-400A傾斜式高速萬能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；98-3數(shù)顯磁力攪拌器：鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；752N紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Agilent7890A/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 美拉德反應(yīng)基液的制備 將廢棄煙末置于圓底燒瓶中，按照一定料液質(zhì)量體積比加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，加入α-淀粉酶和β-淀粉酶，調(diào)節(jié)pH，在適當(dāng)?shù)臏囟认码妱訑嚢璺磻?yīng)一段時(shí)間。在5000r/min下離心30min，取上清液，旋蒸濃縮。

1.2.2 美拉德反應(yīng) 在裝有溫度計(jì)、回流冷凝管的燒瓶中依次加入美拉德反應(yīng)基液、丙二醇與水的混合溶劑60 mL，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%NaOH或6 mol/LHCl調(diào)節(jié)pH，在115℃下，反應(yīng)5 h，反應(yīng)結(jié)束后，在冰水浴中冷卻。

1.2.3 還原糖和水溶性總糖的測定 還原糖：參考文獻(xiàn)[5]提供的方法；水溶性總糖：DNS比色法。

1.2.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)量評定

1）褐變程度的測定 取1 mL美拉德反應(yīng)產(chǎn)物使其溶于10 mL的蒸餾水中，參比為蒸餾水，在752N型紫外分光光度計(jì)下測定420 nm下的吸光值，吸光值越大，其顏色強(qiáng)度就越大，說明美拉德反應(yīng)越充分，得到的反應(yīng)物色澤越好[6]。

2）風(fēng)味評價(jià) 把制備的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物樣品裝入噴霧器中，噴霧器噴灑到低檔次的煙絲上，其中確保噴物量為煙絲質(zhì)量的1.5‰，把噴灑過的煙絲經(jīng)過相應(yīng)處理后，由評吸小組進(jìn)行感官評吸[8]，對其香氣、光澤、協(xié)調(diào)性、刺激性、余味、雜氣6項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評吸打分，評分標(biāo)準(zhǔn)如表1。

1.2.5 GC-MS分析條件

1）美拉德反應(yīng)產(chǎn)物醚溶性成分的分離 取30 mL美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，加15 g NaCl使其飽和，再分別加入40、40、20 mL乙醚，依次萃取，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至1mL，進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用儀器分析[7]。

2）色譜檢測條件 色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）； 程序升溫：60 ℃保持 3 min，以5℃/min的速度升至250℃，并保持20 min；進(jìn)樣溫度：250 ℃；載氣：純 He，載氣流量：1 mL/min；分流比 10∶1；進(jìn)樣量為 1 μL。

表1 各單項(xiàng)指標(biāo)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Score standard about each single index

3）質(zhì)譜檢測條件 離子源溫度：230℃；質(zhì)量掃描范圍為35～500；離子源電子能量：60 eV。MS譜圖：NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)圖進(jìn)行檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一酶酶解對還原糖質(zhì)量體積濃度的影響

由圖1可看出，酶解液上清液中還原糖的質(zhì)量濃度隨著酶用量的增加而增加，最后趨于平衡。α-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～0.1%之間時(shí)，還原糖的質(zhì)量濃度隨著α-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而快速增加，在0.1%～0.2%之間時(shí)，α-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加速率明顯沒有在0～0.1%的快，當(dāng)α-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)，還原糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，再繼續(xù)增加α-淀粉酶用量對還原糖質(zhì)量濃度幾乎沒有變化，因此α-淀粉酶用量的最適區(qū)間為0.1%～0.2%。

圖1 α-淀粉酶和β-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對還原糖質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Influence of α-Amylase and β-Amylase content on the quality volume concentration of reducing sugar

β-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～2.0%時(shí)，還原糖的質(zhì)量濃度隨著β-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而劇烈增加，當(dāng)β-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.0%～3.5%時(shí)，還原糖質(zhì)量濃度雖隨著β-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加，但增加幅度明顯沒有在0～2%之間變化的大，仍有增長的趨勢。因此，選擇β-淀粉酶的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化范圍為2%～3%。

2.2 復(fù)合酶配比組合的篩選

由圖2可看出，當(dāng)雙酶復(fù)配時(shí)，會表現(xiàn)出不同于兩種酶的活性，可促進(jìn)反應(yīng)，也可抑制反應(yīng)。整體還原糖的質(zhì)量體積濃度先隨著復(fù)合酶用量的增加而增加，增加到最大值，接著還原糖的質(zhì)量體積濃度隨復(fù)合酶用量增加又降低。當(dāng)α-淀粉酶用量變化時(shí)，總體變化趨勢是一致的，當(dāng)β-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2%～3%時(shí)，會發(fā)現(xiàn)兩條曲線幾乎是重合的，還原糖的質(zhì)量濃度成上升趨勢，說明在這區(qū)間，α-淀粉酶的用量對還原糖的質(zhì)量濃度影響很??；當(dāng)β-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%～4%時(shí)，兩條曲線完全分開，此時(shí)還原糖的質(zhì)量濃度呈下降趨勢，α-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為在0.2%時(shí)，還原糖的質(zhì)量濃度相對高點(diǎn)。綜合可得雙酶復(fù)配組合最佳為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%α-淀粉酶+3%β-淀粉酶。

圖2 復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對還原糖質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Influence of compound enzyme content on the quality volume concentration of reducing sugar

2.3 復(fù)合酶酶解單因素實(shí)驗(yàn)分析

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%α-淀粉酶和3%β-淀粉酶對廢棄煙末進(jìn)行酶解，分別考察酶解時(shí)間、酶解溫度和酶解pH對酶解的影響。

2.3.1 酶解溫度對復(fù)合酶酶解廢棄煙末效果的影響 由圖3可見，酶解液上清液中還原糖質(zhì)量濃度是先增加至最大值后降低的趨勢。在溫度由30℃開始升高時(shí)，熱運(yùn)動加快，使酶的反應(yīng)速度加快，溫度至50℃時(shí)，這時(shí)還原糖的質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，繼續(xù)增加溫度，酶的反應(yīng)速度會快速降低，此時(shí)溫度過高會使酶蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白酶部分失活，因此復(fù)合酶的最適溫度為50℃。

圖3 溫度對還原糖質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Influence of compound enzyme content on the quality volume concentration of reducing sugar

2.3.2 酶解時(shí)間對復(fù)合酶酶解廢棄煙末的影響由圖4可以看出，還原糖的質(zhì)量濃度總體變化趨勢是：先增加最后趨于平衡的。在1～7 h內(nèi)，說明溶液中有足夠的多糖與酶結(jié)合，使還原糖質(zhì)量濃度增加，速度也比較快，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，多糖逐漸消耗，與酶結(jié)合量減少，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到7 h時(shí)，還原糖的質(zhì)量濃度到達(dá)最大值，之后緩慢變化，趨于平衡。因此，時(shí)間的最佳選擇為7 h。

圖4 時(shí)間對還原糖質(zhì)量體積濃度的影響Fig.4 Influence of reaction time on the quality volume concentration of reducing sugar

2.3.3 酶解pH對復(fù)合酶酶解廢棄煙末效果的影響由圖5可看出，還原糖的質(zhì)量濃度變化的整體趨勢是：隨著pH值的增加先增加后降低的。隨著pH的增加，酶活性隨pH的增加而變大，當(dāng)pH值增加到5.4時(shí)，還原糖的質(zhì)量濃度達(dá)到最大值25.46 mg/mL，此時(shí)酶的反應(yīng)速率也是最快的，隨著pH的繼續(xù)增加，酶催化活性受到抑制，反應(yīng)速率降低，還原糖的質(zhì)量體積濃度也有所降低。因此，復(fù)合酶的最適pH值為5.4。

圖5 pH對還原糖質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Influence of pH on the quality volume concentration of reducing sugar

2.4 美拉德反應(yīng)工藝的優(yōu)化

2.4.1 氨基酸種類的確定 根據(jù)酶解液中還原糖的質(zhì)量體積濃度計(jì)算出濃縮液中還原糖的質(zhì)量，采用氨基酸與糖類的摩爾比為1∶1進(jìn)行美拉德反應(yīng)。各取3 g的L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-苯丙氨酸分別與 6.06、3.67、4.46、2.25、3.25 g的復(fù)合酶酶解的濃縮液加入圓底燒瓶中，再加入51 mL的1，2-丙二醇與9 mL的蒸餾水，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%NaOH或6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 7，反應(yīng)溫度為100℃，在磁力攪拌器中回流5 h。經(jīng)過相應(yīng)的處理，測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的顏色強(qiáng)度和評吸得分，結(jié)果見圖6。

圖6 氨基酸的種類對美拉德反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of the kind of amino acid on Maillard reaction

氨基酸種類的不同，會使美拉德反應(yīng)速率不同，其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的組成與香氣特征也不同，由圖6可知，L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸的顏色強(qiáng)度分別為：1.521、1.6、1.41、1.223、1.295，L-丙氨酸數(shù)值最高， 說明其反應(yīng)比其他氨基酸反應(yīng)充分。評吸得分分別為83、81、75、60、51，雖然 L-谷氨酸評吸得分最高，但其反應(yīng)程度沒有L-丙氨酸大，因此選擇氨基酸為L-丙氨酸。

2.4.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化美拉德反應(yīng)的工藝 試驗(yàn)中，根據(jù)含水量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和pH值等因素的影響，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（如表2）在不同條件下合成了一系列新型香料。通過感官評吸和褐變程度，確定試驗(yàn)的最佳條件。

表 2 3 水平 4 因素 L9（34）正交表Table 2 Orthogonal table for L9（34）

由表2的數(shù)據(jù)可知：pH值、溫度、時(shí)間、反應(yīng)系含水率對顏色強(qiáng)度的影響大小。極差的值表現(xiàn)出因素對顏色強(qiáng)度的影響情況，極差值越大，說明對顏色強(qiáng)度的影響越深。右表2可知，4個(gè)因素的極差值由大到小分別為：R時(shí)間＞R溫度＞R反應(yīng)系含水率＞RpH值。 可知時(shí)間對美拉德反應(yīng)影響最深，其次，溫度，影響最小的則為pH值。

按均值選取最佳水平。通過比較每個(gè)因素的3個(gè)均值大小，選擇均值最大的為最佳水平，最佳水平為A3B3C3D2。也就是，美拉德反應(yīng)的最佳條件為：pH值為8、溫度115℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%。在此條件下重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，得到顏色強(qiáng)度的平均值為1.617，根據(jù)卷煙評吸程序得到的評吸得分的平均值為79?？傮w上來說，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的香氣比較純正、干凈，刺激性小。

2.4.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的GC-MS分析 酶解煙草廢棄物進(jìn)行美拉德反應(yīng)得到的產(chǎn)物，共檢測出100種物質(zhì)，其中與煙草香味有關(guān)的化合物有57種，所占的相對百分含量為71.277%，如圖7各種致香成分所占百分比。主要包括吡嗪類、吡咯類、吡啶類、吲哚類、醇類、酸類、呋喃類、酮類、酯類、醛類、酚類、羰基類、芳香族類、烷烴類等，這些物質(zhì)大多數(shù)由美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的，作為煙用香精能產(chǎn)生較好的陳煙香，略帶甜香，煙氣細(xì)順。

圖7 致香成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.7 Percentage of aroma components

3 結(jié)語

作者以煙草廢棄物為原料，以還原糖得率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)，確定酶法制備美拉德反應(yīng)基液的工藝為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%α-淀粉酶與3%β-淀粉酶，溫度為50℃，緩沖溶液pH值為5.4，反應(yīng)時(shí)間為7 h，該條件下還原糖的質(zhì)量濃度為25.46 mg/mL。該試驗(yàn)為美拉德反應(yīng)提供了天然又充足的還原糖，節(jié)省了原料，使煙草廢棄物得到了資源化利用。另外，利用復(fù)合酶酶促水解液和外加氨基酸進(jìn)行美拉德反應(yīng)，通過正交試驗(yàn)確定最佳反應(yīng)工藝：外加氨基酸為丙氨酸，pH值為8、溫度115℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、反應(yīng)系含水率為15%。在最佳條件下進(jìn)行的美拉德反應(yīng)，通過GC-MS可檢測出共檢測出100種物質(zhì)，其中與煙草香味有關(guān)的化合物有57種，這些物質(zhì)具有沁鼻的烘烤味和甜香，能改善煙草吸食品質(zhì)，促進(jìn)其風(fēng)味，對卷煙加香能夠起到很好的修飾作用。