徐秋月 ， 周志磊 ， 毛 健 *， 岳翠益 ， 李志威

（1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；3.食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；4.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000；5.江南大學(xué) 食品生物技術(shù)研究所（如皋），江蘇 如皋 226500）

黃酒釀造是以糯米、麥曲等為原料，在霉菌、酵母和細(xì)菌等多種微生物及其酶類共同參與條件下進(jìn)行的邊糖化邊發(fā)酵的復(fù)雜的生物化學(xué)過程[1]。黃酒中有豐富的營養(yǎng)保健成分，其中多酚類物質(zhì)已經(jīng)成為黃酒研究的熱點(diǎn)，因?yàn)槠漭^強(qiáng)的清除自由基和抗氧化等功能性作用。酚類物質(zhì)主要有類黃酮和非類黃酮2大類[2]。這些物質(zhì)除了具有一定的生理活性之外，還對(duì)黃酒的色澤、收斂性、苦味等感官特性有貢獻(xiàn)[3-4]。

黃酒為多菌種發(fā)酵，成品酒中含有多種大分子物質(zhì)，這些物質(zhì)為多酚物質(zhì)的純化、分離及測(cè)定帶來很大困難。紫外分光光度法、毛細(xì)電泳一電化學(xué)方法、高效液相色譜法（HPLC法）等方法是目前國內(nèi)外報(bào)道的關(guān)于黃酒中多酚的主要檢測(cè)方法[5]。葉杰等[6]利用Folin-Cioeaheu分光光度法測(cè)定了黃酒中總多酚類物質(zhì)，該法簡便、快速、準(zhǔn)確，但只能對(duì)總多酚進(jìn)行測(cè)定，無法定性和定量測(cè)定其中特定的多酚。雷萍等[7]采用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法同時(shí)分離測(cè)定了黃酒中表兒茶素、蘆丁、金絲桃甙、山萘酚、綠原酸、槲皮素等多種生物活性成分的含量。但是黃酒中有還原性多酚和氧化性多酚，利用電化學(xué)的氧化性只能測(cè)定還原性多酚含量，不夠準(zhǔn)確。

目前，高效液相色譜（HPLC）法由于其更高效、更靈敏、更準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)成為定量檢測(cè)酒類中多酚物質(zhì)的常用方法，廣泛運(yùn)用到葡萄酒、蘋果酒等果酒中[8-10]。近年來，也開始運(yùn)用到黃酒的多酚檢測(cè)中[11]。但是黃酒相對(duì)于其他單菌種發(fā)酵酒干擾雜質(zhì)較多，而且多酚化合物含量較低，直接進(jìn)樣或者普通前處理往往無法精確定量。為了更準(zhǔn)確地對(duì)黃酒中的多酚物質(zhì)進(jìn)行定性定量測(cè)定，尋找一種有效的前處理手段成為目前黃酒多酚檢測(cè)的重點(diǎn)。目前以乙酸乙酯、乙醚作為萃取劑的液液萃取法使用廣泛，然而該方法有缺乏選擇性、提取時(shí)間長、有機(jī)溶劑用量多等缺點(diǎn)。固相萃取柱萃取與傳統(tǒng)的液液萃取方法相比，具有萃取速度快，實(shí)驗(yàn)成本低，對(duì)環(huán)境的污染少，不出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，有針對(duì)性等優(yōu)點(diǎn)，并且操作簡單，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化[12-13]。作者通過對(duì)固相萃取柱萃取條件的選擇優(yōu)化建立了利用固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定黃酒中幾種多酚類物質(zhì)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

紹興傳統(tǒng)黃酒樣品：常見市售品牌。甜型（糖質(zhì)量濃度≥100 g/L）3種，半甜型（糖質(zhì)量濃度40～100 mg/L）4 種，半干型（糖質(zhì)量濃度 15～40 mg/L）4 種，干型（糖質(zhì)量濃度≤15 mg/L）3種。

1.2 儀器和試劑

儀器：Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)：美國Waters公司產(chǎn)品；EL3002電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

試劑：甲醇，乙腈，乙酸，乙醚，丙酮（色譜純）：購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乳酸，沒食子酸，表兒茶素，兒茶素，丁香酸，原兒茶酸，蘆丁，槲皮素，p-香豆酸，阿魏酸等（色譜純）：購于Sigma公司；實(shí)驗(yàn)中用水均為超純水，Mili-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 參考成宇峰[14]等的方法，并稍加修改。

色譜柱：Athena C18-WP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流量：0．8 mL／min：柱溫：30 ℃。 檢測(cè)波長：280 nm。

梯度洗脫：流動(dòng)相 A：V（水）∶V（乙酸）=98∶2；流動(dòng)相B：乙腈。洗脫程序：0～8 min，B體積分?jǐn)?shù)為12%；8～20 min，B 體積分 數(shù)為 18%～40%；20～25 min，B體積分?jǐn)?shù)為40%～0%。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 分別稱取6.2 mg兒茶素，2.5 mg阿魏酸、蘆丁，10.0 mg沒食子酸，5.0 mg原兒茶酸、p-香豆酸，3.1 mg表兒茶素、槲皮素、丁香酸標(biāo)樣，用色譜純甲醇定容于10 mL容量瓶中，配成單標(biāo)溶液，各取2 mL單標(biāo)溶液于25 mL容量瓶中定容，將此溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將1.3.2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋成0.25～50 mg/L 8個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度的9種多酚混合標(biāo)樣，按上述確定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，以質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，計(jì)算得到9條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 SPE柱萃取方法 活化：用5 mL甲醇、5 mL超純水對(duì)固相萃取小柱進(jìn)行活化；上樣：取經(jīng)0.1 mol/L HCL（2 mL）調(diào)節(jié)pH后的2 mL酒樣，上樣，重力作用下自流；洗滌：酒樣流完后取3倍酒樣體積的超純水沖洗小柱，棄去廢液；洗脫：4 mL甲醇將多酚類物質(zhì)洗脫下來；氮吹：洗脫液經(jīng)氮吹定容至1 mL，經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，HPLC測(cè)定[15-17]。

1.3.5 回收率的測(cè)定 準(zhǔn)確量取已測(cè)得質(zhì)量濃度的黃酒樣品20 mL，置于25 mL容量瓶中，分別準(zhǔn)確加入一定量的多酚類化合物對(duì)照品溶液，充分振蕩均勻后，按照1.3.4“SPE柱萃取方法”步驟處理，然后平行測(cè)定5次，將測(cè)得的峰面積代入回歸方程，計(jì)算各多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并計(jì)算出平均加標(biāo)回收率。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析 利用 Excel2013、SPSS statistics 20.0、Origin Pro 9.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線性質(zhì)

液相條件參考成宇峰等[14]的方法，結(jié)果顯示 9種多酚能夠達(dá)到基線分離且峰形較好（圖1）。按照1.3.3方法計(jì)算得到9條標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表1，由表中可以看出該方法9條曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.999，其檢測(cè)限LOD均在0.027～0.798 mg/L之間，定量限LQD在0.092～1.664 mg/L之間，表明該方法檢測(cè)靈敏度較高。

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Polyphenols standard chromatogram

2.2 固相萃取方法的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱類型的優(yōu)化 多酚類化合物都屬于強(qiáng)極性化合物，所以作者選用之前文獻(xiàn)中報(bào)道[20-21，23]的對(duì)極性化合物保留能力較強(qiáng)或者選擇性較廣的4種SPE小柱進(jìn)行前處理操作，4種小柱分別 為 ：CNEBOND LC-C18 SPE 小 柱 、CNEBOND HC-C18 SPE小柱、Waters OAsis HLB SPE小柱、CNW Poly-Sery PSD SPE小柱，其各自加標(biāo)回收率結(jié)果如圖2。

表1 工作曲線及檢測(cè)限Table 1 Regression equation and detectjon limit of 9 kinds ofphenolic compounds

圖2 不同固相萃取小柱對(duì)9種多酚的加標(biāo)回收率Fig.2 Effect of different solid phase extraction cartridge on 9 kinds of polyphenols sample added recovery

由圖2可以看出HC-C18、PSD兩種固相萃取小柱對(duì)9種多酚的回收率均偏低，除個(gè)別以外均低于60%。Dominico A.Guillen等[21]曾論述過CNWBOND HC-C18、屬于最常用的硅膠基質(zhì)反相SPE小柱，Poly-Sery PSD的基質(zhì)為一種高交聯(lián)度、中性的、特殊潔凈的苯乙烯/二乙烯苯共聚物，通常用于反相條件下保留含有親水基團(tuán)的疏水性化合物，這兩種柱最大的特點(diǎn)是選擇性很廣，但是針對(duì)強(qiáng)極性化合物吸附能力不強(qiáng)，與作者得到的結(jié)果相符。由圖2可以看出LC-C18固相小柱對(duì)p-香豆酸、阿魏酸、表兒茶素、丁香酸、蘆丁5種多酚的回收率在80%～108%之間，可能是因?yàn)镃NWBOND LC-C18含碳量比HC-C18低，所以具有其一定的選擇性，更適用于分離極性化合物，但是CNWBOND LC-C18對(duì)兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸、槲皮素4種多酚的回收率均低于60%；HLB固相小柱除去對(duì)阿魏酸的回收率略偏低（70%），對(duì)其余8種多酚的回收率均在88%～106%之間，這項(xiàng)結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道相符。Nuria Fontanals等[20]研究了SPE柱對(duì)極性化合物的吸附作用，指出Poly-Sery HLB SPE作為酸性、中性、堿性化合物最通用、最廣泛的吸附劑，其基質(zhì)是改性的二乙烯苯聚合物，能滿足所有SPE要求的親水-親脂平衡HLB反相吸附劑。因此，它顯示出對(duì)多種不同分析物特別對(duì)極性化合物保留的特性，相對(duì)保留容量較傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)SPE（如C18）高3倍以上。此種小柱對(duì)黃酒中多酚物質(zhì)的保留能力較強(qiáng)，作者選擇Poly-Sery HLB小柱作為本實(shí)驗(yàn)的固相萃取小柱。

2.2.2 洗脫試劑的優(yōu)化 不同的洗脫溶劑對(duì)多酚物質(zhì)洗脫能力不同，選擇4種常用有機(jī)試劑作為洗脫劑，分別計(jì)算其加標(biāo)回收率，結(jié)果如圖3。

圖3 不同洗脫試劑類型對(duì)9種多酚的加標(biāo)回收率Fig.3 Effect of different eluent on 9 kinds of polyphenolssample added recovery

由圖3可以看出，4種洗脫試劑中，乙醚和丙酮的加標(biāo)回收率較低，除乙醚對(duì)原兒茶酸的回收率（85%）和丙酮對(duì)蘆丁的回收率（103%）較高以外，其余均低于70%，而且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)乙醚揮發(fā)性極強(qiáng)，不容易控制，所以這兩種洗脫試劑均不合適。乙腈對(duì)兒茶素 （103%）、p-香豆酸 （102%）、丁香酸（98%）的洗脫能力都較強(qiáng)，但是乙腈對(duì)阿魏酸、表兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸的回收率都低于70%；甲醇對(duì)阿魏酸的洗脫能力相較于其他幾種多酚較低（74%），但是對(duì)于其他8種多酚的回收率均在86%～102%之間，說明甲醇對(duì)多酚物質(zhì)的洗脫能力較強(qiáng)，所以選用甲醇作為本實(shí)驗(yàn)的洗脫試劑。

2.2.3 洗脫試劑體積的優(yōu)化 洗脫試劑的體積多少會(huì)影響洗脫效果，所以對(duì)洗脫劑體積進(jìn)行優(yōu)化。分別以 2、4、6、8、10 mL 甲醇作為洗脫劑，計(jì)算其加標(biāo)回收率，結(jié)果如圖4。

由圖4可以看出當(dāng)洗脫試劑為2 mL時(shí)，9種多酚的回收率除原兒茶酸（78%）以外的8種多酚的回收率都較低，均低于70%，隨著洗脫試劑的增加，各多酚化合物的回收率呈上升趨勢(shì)，p-香豆酸、阿魏酸、表兒茶素、丁香酸、蘆丁、沒食子酸、原兒茶酸、槲皮素在洗脫劑體積為6 mL時(shí)回收率達(dá)到最大，9種多酚回收率在6 mL洗脫劑時(shí)均有很大程度提高，在89%～104%之間；兒茶素在洗脫劑體積為8 mL時(shí)達(dá)到最大，但相對(duì)于4 mL變化幅度很小，當(dāng)洗脫體積大于6 mL時(shí)，隨著洗脫試劑的體積的升高，回收率會(huì)出現(xiàn)小幅度下降，可能是因?yàn)樵诘档倪^程中會(huì)有損失導(dǎo)致。鑒于以上結(jié)果，結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作方便，最終選定洗脫劑體積為6 mL即3倍上樣體積。

圖4 不同洗脫試劑體積對(duì)9種多酚的加標(biāo)回收率Fig.4 Effect of different eluent volume on 9 kinds of polyphenols sample added recovery

2.3 回收率及精密度

根據(jù)上述優(yōu)化的條件處理酒樣，并按照1.3.5所述方法計(jì)算出該方法平均加標(biāo)回收率及精密度，結(jié)果見表2。p-香豆酸、表兒茶素、丁香酸、兒茶素、蘆丁、沒食子酸、原兒茶酸、槲皮素8種多酚的回收率均在84.2%～103.8%之間，阿魏酸回收率當(dāng)添加量為10 mg/L時(shí)相對(duì)較低，為70.8%，但當(dāng)添加量較少時(shí)其回收率提高為87.3%，整體回收率較高；相對(duì)偏差RSD均小于3.2%，方法準(zhǔn)確度較高。

2.4 黃酒樣品測(cè)定

運(yùn)用以上優(yōu)化的固相萃取條件處理黃酒樣品，運(yùn)用HPLC定量測(cè)定黃酒中的9種多酚。圖5（a）為未過SPE柱黃酒樣品峰圖，圖5（b）為過SPE柱黃酒樣品峰圖。對(duì)市場(chǎng)上采購的14種紹興地區(qū)4種不同甜型的傳統(tǒng)黃酒進(jìn)行了多酚含量的檢測(cè)，結(jié)果見圖6。

由圖5（a）可知未經(jīng)過前處理的黃酒樣峰圖前部分雜質(zhì)峰較多，且雜質(zhì)峰信號(hào)高，導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)峰信號(hào)較弱，不容易精確定量。由于Poly-Sery HLB SPE基質(zhì)是改性的二乙烯苯聚合物，針對(duì)極性化合物有很強(qiáng)的保留特性，所以經(jīng)過SPE柱處理之后，目標(biāo)物多酚被保留下來，再用有機(jī)試劑洗脫下來并進(jìn)行濃縮。經(jīng)過處理之后的樣品雜質(zhì)物質(zhì)明顯減少，而目標(biāo)物質(zhì)峰分離較好，信號(hào)較強(qiáng)，從而可以完成準(zhǔn)確定量，說明固相萃取是一種有效的黃酒前處理手段，可以有針對(duì)性地除雜、對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行富集濃縮，使得黃酒多酚測(cè)定更準(zhǔn)確。

表 2 方法的精密度和回收率（n=5）Table 2 Precision and recovery of the method（n=5）

圖5 原黃酒樣和過SPE柱黃酒樣品色譜圖Fig.5 Chinese rice wine sample chromatograms

圖6 不同甜型黃酒的多酚測(cè)定結(jié)果Fig.6 Determination results of different type of sweet rice wine polyphenols

由圖6可知，在黃酒中，總多酚質(zhì)量濃度為86.24～115.70 mg/L。 葉杰、倪莉[6]用 Folin—ciocalteu法測(cè)定黃酒中總多酚含量為376～582 mg/L，福林酚法測(cè)定的是黃酒中的總多酚含量，其原理是多酚與相應(yīng)試劑發(fā)生特異性反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)特定波長的有最大吸收，且吸光度值與多酚的量在一定濃度范圍內(nèi)成線性關(guān)系，此方法存在較大誤差，使用HPLC法測(cè)定黃酒中的9種常見多酚，還有一部分未測(cè)定的酚酸類及黃烷醇類，故要比福林酚法測(cè)定的總含量要低。本實(shí)驗(yàn)中，兒茶素與丁香酸為質(zhì)量濃度最高的兩種酚酸，4種甜型黃酒中兒茶素質(zhì)量濃度在21.73～53.86 mg/L之間，丁香酸質(zhì)量濃度在2.11～11.38 mg/L之間，這與Que F等[22]運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定的黃酒中多酚所得結(jié)果一致有小幅度偏高，是由于固相萃取法可以將多酚更好地富集，所得的回收率更高。由圖6可知，p-香豆酸、蘆丁含量在4種甜型黃酒中有顯著性差異（p＜0.05），均為甜型黃酒質(zhì)量濃度最高，干型黃酒質(zhì)量濃度最低；阿魏酸質(zhì)量濃度在4種甜型黃酒中質(zhì)量濃度為0.34～1.92 mg/L之間，在半干和半甜型黃酒中質(zhì)量濃度沒有顯著性差異，在甜型黃酒中質(zhì)量濃度最高，干型黃酒中質(zhì)量濃度最低；表兒茶素與槲皮素質(zhì)量濃度在0.42～2.38 mg/L之間，其中甜型與半甜型兩種黃酒這兩種多酚質(zhì)量濃度沒有顯著性差異，質(zhì)量濃度均大于干型與半干型黃酒；丁香酸質(zhì)量濃度在4種甜型黃酒中有顯著性差異，其中半甜型與半干型質(zhì)量濃度大于干型與甜型；兒茶素質(zhì)量濃度在半干、半甜、甜型3種黃酒中無顯著性差異，均遠(yuǎn)大于干型黃酒中質(zhì)量濃度；沒食子酸質(zhì)量濃度在4.26～6.02 mg/L之間，其中半甜型黃酒中質(zhì)量濃度最高而干型黃酒中質(zhì)量濃度最低；原兒茶酸只在干型與半干型黃酒中檢測(cè)出，質(zhì)量濃度分別為1.77、0.39 mg/L，而在甜型、半甜型黃酒中均未檢出。另外，由結(jié)果還可以看出9種多酚在不同甜型傳統(tǒng)黃酒中，在半干與干型黃酒中質(zhì)量濃度普遍低于甜型與半甜型黃酒，尤其干型黃酒質(zhì)量濃度相較于其他甜型黃酒大幅度偏低，這可能與其生產(chǎn)工藝有關(guān)，還待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 語

1）采用固相萃取作為前處理方法，就固相萃取小柱類型、洗脫劑類型、洗脫劑體積等因素對(duì)9種多酚的回收率做了評(píng)價(jià)比較。經(jīng)過優(yōu)化，采用Poly-Sery HLB SPE小柱，甲醇為洗脫劑，洗脫體積為3倍上樣體積9種多酚回收率最高，在87.3%～103.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.2%。

2）運(yùn)用該方法對(duì)不同甜型的紹興黃酒中多酚含量進(jìn)行精確測(cè)定，不同甜型的傳統(tǒng)黃酒中多酚以兒茶素和丁香酸為主，干型黃酒、半干型黃酒中多酚含量低于甜型黃酒和半甜型黃酒。該方法測(cè)定黃酒中多酚含量，不僅簡便、快速，而且靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高，也可以作為復(fù)雜基體食品中多酚的分析方法。