李兆萌， 劉 沖， 李 揚(yáng)， 徐朋朋， 王 堃， 李經(jīng)民

(1.大連理工大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，遼寧 大連 116024;2.大連理工大學(xué) 遼寧省微納米技術(shù)及系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116024)

0 引 言

急性心肌梗塞的早期診斷對(duì)于此類疾病的治療具有重要意義[1]。在急性心肌梗塞最初發(fā)作的3～6 h內(nèi)[2]，人體血液中的一種肌鈣蛋白—心肌鈣蛋白I(分子量22.5kDa(1Da=1.660 538 921×10-27kg/mol))的濃度從10 ng/mL左右迅速上升至50 ng/mL[3]，最終能夠高達(dá)550 ng/mL[4]。心肌鈣蛋白I的這種高濃度狀態(tài)將持續(xù)保持6～8天，這為急性心肌梗塞的診斷提供了一個(gè)較長(zhǎng)的窗口期[5]。與肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白等其他生化標(biāo)志物相比，心肌鈣蛋白I具有突出的心肌損傷特異性，被視為診斷急性心肌梗塞的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。因此，在急性心肌梗塞的早期階段，對(duì)于濃度升高的心肌鈣蛋白I的高靈敏度檢測(cè)方法顯得特別迫切。

電化學(xué)酶?jìng)鞲衅髟诩膊≡\斷方面具有操作簡(jiǎn)單、精度較高等優(yōu)點(diǎn)[7]。微帶陣列電極不僅保持了單個(gè)微帶電極IR降小、擴(kuò)散電流密度大和RC常數(shù)小等優(yōu)點(diǎn)，并極大地提高了電流強(qiáng)度[8]。在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中，要求檢測(cè)樣本體積小，且為了避免交叉感染需要使用一次性裝置，因此檢測(cè)通常和微機(jī)電系統(tǒng)(micro-electro-mechanical system,MEMS)相結(jié)合[9]。

本文設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單可靠、靈敏迅速的電化學(xué)免疫傳感器，用于人體心肌鈣蛋白I的濃度檢測(cè)。這種傳感器由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)溝道片和集成了微帶陣列電極的玻璃片組成。傳感器所產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度正比于心肌鈣蛋白I的濃度，可用于人體急性心肌梗塞的早期診斷。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 微流控芯片設(shè)計(jì)

微流控芯片由一片PDMS溝道片(20 mm×6 mm×2 mm)和一片玻璃電極片(34 mm×11 mm×2 mm)組成，如圖1(a)所示。PDMS溝道片內(nèi)部溝道的深度為50 μm，寬度為500 μm，長(zhǎng)度為12 mm，體積為0.3 μL。玻璃電極片由工作電極、參比電極和對(duì)電極三電極系統(tǒng)組成，電極材料均為Au，如圖1(b)所示。其中，工作電極由25對(duì)微型梳指交叉電極組成，每個(gè)梳指的寬度為40 μm，長(zhǎng)度為2 mm，間隔為80 μm。由于進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)時(shí)，只使用梳指交叉電極的一半進(jìn)行工作，故工作電極仍為微帶陣列電極。參比電極和對(duì)電極均為長(zhǎng)2 mm、寬1 mm的長(zhǎng)方形結(jié)構(gòu)；電極末端焊盤長(zhǎng)度為8 mm，寬度為1 mm。

圖1 微流控芯片和玻璃電極片

1.2 微流控芯片制造

玻璃電極片的制作過(guò)程(圖2)為：(a)在一片Pyrex耐熱玻璃上，依次濺射一層10 nm厚的鉻薄膜和200 nm厚的金薄膜；(b)在金薄膜表面旋涂一層BP212光刻膠，轉(zhuǎn)速為2 600 r/min,在85 ℃下前烘處理30 min；(c)利用曝光機(jī)在掩膜下對(duì)光刻膠進(jìn)行紫外曝光，將光刻膠浸入0.5 % NaOH溶液中，進(jìn)行顯影，在85 ℃下烘處理30 min；(d)利用1 g I2，5 g KI和50 mL H2O的混合溶液，腐蝕金薄膜；(e)利用H4CeN2O3和HClO4的混合溶液腐蝕鉻薄膜；利用丙酮去除掉殘余的光刻膠，得到金電極。

圖2 玻璃電極片制作流程

1.3 檢測(cè)原理

微流控芯片檢測(cè)心肌鈣蛋白I的為:首先，對(duì)和電極組裝之后的PDMS溝道進(jìn)行硅烷化修飾，在其表面形成羧基基團(tuán)，并將蛋白G固定于修飾好的硅烷層上。蛋白G可以和心肌鈣蛋白I包被抗體的Fc片段進(jìn)行特異性結(jié)合，使得心肌鈣蛋白I包被抗體的Fab片段裸露出來(lái)并保持特定的方向。檢測(cè)時(shí)，包被抗體和心肌鈣蛋白I抗原充分結(jié)合并將其固定[10]，固定之后的心肌鈣蛋白I抗原和心肌鈣蛋白I檢測(cè)抗體(用堿性磷酸酶標(biāo)記)進(jìn)行特異性結(jié)合，使得三者之間形成三級(jí)夾心結(jié)構(gòu)[11]。

實(shí)驗(yàn)以對(duì)氨基磷酸苯酯(phenyl phosphor amidate,PPA)作為反應(yīng)底物，對(duì)氨基磷酸苯酯(phenyl p-aminophosphate,PPAP)在堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)的催化作用下生成對(duì)氨基磷酸苯酚(phenol p-amino phosphate,PAP)，PAP在正電位作用下會(huì)生成醌亞胺(quinone-imine,PQI)[12]。利用循環(huán)伏安法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，測(cè)得的循環(huán)伏安曲線中氧化峰的峰值和生成的PAP的濃度成正比，進(jìn)而可以標(biāo)定參與反應(yīng)的心肌鈣蛋白I的濃度。

1.4 試劑材料

蛋白G(由G型鏈球菌分離而得，可以和抗體的Fc片段特異性結(jié)合)、對(duì)氨基磷酸苯酯購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。高錳酸鉀(KMnO4)、7—辛烯基三氯硅烷(C8H15Cl3Si)、三氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCL sodium)、牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的小鼠免疫球蛋白G(IgG)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)購(gòu)于北京雷根生物技術(shù)有限公司。人體心肌鈣蛋白I抗原(cTnI)、小鼠心肌鈣蛋白I單克隆包被抗體(M18)、小鼠心肌鈣蛋白I單克隆檢測(cè)抗體(M4)于美國(guó)Fitzgerald公司購(gòu)買。AP試劑盒購(gòu)于英國(guó)Innova Biosciences公司，可以對(duì)小鼠心肌鈣蛋白I單克隆檢測(cè)抗體(M4)進(jìn)行標(biāo)記。

1.5 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

為了能夠?qū)⑿募♀}蛋白I包被抗體固定于PDMS溝道內(nèi)表面，需要對(duì)溝道內(nèi)表面進(jìn)行硅烷化。硅烷化過(guò)程是利用C8H15Cl3Si,KMnO4溶液等對(duì)通道進(jìn)行修飾，產(chǎn)生羧基基團(tuán)。硅烷化后形成的羧基基團(tuán)可以將蛋白G固定，剩余的羧基空位用牛血清蛋白溶液進(jìn)行封閉。為了驗(yàn)證抗體在PDMS溝道內(nèi)表面的固著特性，實(shí)驗(yàn)采用FITC標(biāo)記的小鼠免疫球蛋白G和溝道內(nèi)表面修飾后形成的蛋白G層進(jìn)行有效結(jié)合，通過(guò)在激光共聚焦顯微鏡下圖像的熒光強(qiáng)度進(jìn)行表征。具體方法如下：在對(duì)微流控芯片修飾形成蛋白G層之后，將FITC標(biāo)記的小鼠免疫球蛋白G注入PDMS溝道中，保持10 min，用磷酸鹽緩沖液將沒(méi)有固定的小鼠免疫球蛋白G沖洗掉。將經(jīng)過(guò)以上處理的芯片置于激光共聚焦顯微鏡下，采用10倍物鏡，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為488 nm，觀察PDMS溝道內(nèi)表面的熒光強(qiáng)度。

實(shí)驗(yàn)的核心部分為驗(yàn)證微流控芯片對(duì)于心肌鈣蛋白I的電化學(xué)免疫分析功能，具體操作流程如下：1)對(duì)微流控芯片修飾形成蛋白G層后，將心肌鈣蛋白I包被抗體(30 μg/mL)注入芯片中;2)將分析物心肌鈣蛋白I(10 ng/mL)注入芯片中；3)將堿性磷酸酶標(biāo)記的心肌鈣蛋白I檢測(cè)抗體(10 μg/mL)注入芯片中；4)對(duì)芯片注入對(duì)氨基磷酸苯酯溶液(溶解在三氨基甲烷鹽酸鹽中，4 mmol/L)，利用電化學(xué)工作站檢測(cè)此時(shí)的循環(huán)伏安曲線。電化學(xué)工作站的掃描電壓范圍為-0.15～0.15 V，掃描頻率為100 mV/s。由于對(duì)氨基磷酸苯酯溶液在堿性條件下容易被氧化，并對(duì)光照非常敏感，故需要每天新鮮配置，且實(shí)驗(yàn)需要在黑暗的環(huán)境下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗體在PDMS溝道內(nèi)表面的固著特性

為了驗(yàn)證抗體在PDMS溝道內(nèi)表面的固著特性，本研究采用3組芯片進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，以證明蛋白G與抗體的特異結(jié)合性能。1)芯片為空白組，不進(jìn)行任何處理；2)芯片在PDMS溝道內(nèi)表面硅烷化之后，直接固定BSA，不進(jìn)行蛋白G修飾；3)芯片在PDMS溝道內(nèi)表面硅烷化之后，進(jìn)行蛋白G層修飾，剩余空位用牛血清蛋白溶液進(jìn)行填補(bǔ)。分別向3組芯片中注入FITC標(biāo)記的小鼠免疫球蛋白G，保持10 min，然后用PBS沖洗。將3個(gè)芯片分別在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。

圖3(a)為第(1)組檢測(cè)不到熒光，因?yàn)镕ITC標(biāo)記的小鼠免疫球蛋白G不能直接在PDMS溝道內(nèi)表面固著。圖3(b)顯示第(2)組熒光強(qiáng)度有了稍微的增加，這表明牛血清蛋白可以和PDMS溝道內(nèi)表面硅烷層上的羧基結(jié)合，阻止了小鼠免疫球蛋白G和溝道上羧基的結(jié)合。微弱的熒光強(qiáng)度說(shuō)明FITC標(biāo)記的小鼠免疫球蛋白G可能和形成的牛血清蛋白層發(fā)生了不明確的物理吸附。圖3(c)顯示了第(3)組芯片具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，這是由于FITC標(biāo)記的小鼠免疫球蛋白G的Fc片段和蛋白G層發(fā)生了有效結(jié)合，證實(shí)了抗體在PDMS溝道內(nèi)表面的有效固著。

圖3 PDMS溝道內(nèi)表面共聚焦顯微鏡圖像

2.2 微流控芯片電化學(xué)免疫分析的性能評(píng)估

為了證實(shí)微流控芯片內(nèi)部的酶反應(yīng)過(guò)程，對(duì)芯片電化學(xué)免疫分析的性能進(jìn)行評(píng)估，本實(shí)驗(yàn)同樣設(shè)計(jì)了3組芯片，利用電化學(xué)工作站對(duì)其性能進(jìn)行表征。1)對(duì)沒(méi)有硅烷化的芯片直接注入磷酸鹽緩沖液，測(cè)得此時(shí)的循環(huán)伏安曲線作為一個(gè)背景信號(hào)。2)在對(duì)微流控芯片修飾形成蛋白G層之后，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟，將包被抗體(30 μg /mL)通過(guò)蛋白G修飾層固定于硅烷化的PDMS溝道內(nèi)表面，然后在芯片中依次注入心肌鈣蛋白I(10 ng/mL)、AP標(biāo)記的檢測(cè)抗體(10 μg/mL)，用磷酸鹽緩沖液沖洗，測(cè)得此時(shí)的循環(huán)伏安曲線作為一個(gè)對(duì)比信號(hào)。3)在第二組的基礎(chǔ)上，對(duì)芯片注入對(duì)氨基磷酸苯酯溶液(溶解在三氨基甲烷鹽酸鹽中，4 mmol/L)，保持1 min，利用電化學(xué)工作站檢測(cè)此時(shí)的循環(huán)伏安曲線。

如圖4曲線A和B所示，第(1)組和第(2)組芯片各自的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電流很弱，幾乎沒(méi)有峰值。表明這2組芯片中并沒(méi)有電活性物質(zhì)產(chǎn)生，因而不會(huì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)。第(3)組芯片利用循環(huán)伏安法測(cè)得的氧化電流峰值為586 nA，(曲線C)。這表明在PDMS溝道內(nèi)部對(duì)心肌鈣蛋白I包被抗體、心肌鈣蛋白I和心肌鈣蛋白I檢測(cè)抗體發(fā)生了成功有效的固著，并且標(biāo)記的AP和底物對(duì)氨基磷酸苯酯發(fā)生了反應(yīng)。

圖4 不同芯片的循環(huán)伏安檢測(cè)曲線

2.3 心肌鈣蛋白I的循環(huán)伏安曲線和檢測(cè)范圍

本文對(duì)微流控芯片的靈敏度和檢測(cè)范圍進(jìn)行了確定。圖5給出了檢測(cè)芯片對(duì)于不同濃度的心肌鈣蛋白I的循環(huán)伏安檢測(cè)曲線以及相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線，利用循環(huán)伏安法測(cè)得的氧化電流峰值隨著心肌鈣蛋白I濃度的增大而增大。其中，心肌鈣蛋白I包被抗體的濃度為30 μg/mL，堿性磷酸酶標(biāo)記的心肌鈣蛋白I檢測(cè)抗體的濃度為10 μg/mL，心肌鈣蛋白I的檢測(cè)濃度范圍為1～1 000 ng/mL，所有修飾和檢測(cè)過(guò)程均按上述步驟進(jìn)行。根據(jù)校準(zhǔn)曲線計(jì)算所得到的心肌鈣蛋白I理論最低檢測(cè)限為0.4 ng/mL。

圖5 心肌鈣蛋白I循環(huán)伏安曲線(插圖為相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線)

3 結(jié) 論

研制了一種用于檢測(cè)人體急性心肌梗塞早期階段心肌損傷標(biāo)志物,即心肌鈣蛋白I的電化學(xué)生物芯片。通過(guò)研究證明，該芯片具有良好的電化學(xué)檢測(cè)性能和較高的檢測(cè)靈敏度。芯片所需檢測(cè)樣品體積為0.3 μL，從注入心肌鈣蛋白I到獲得電化學(xué)信號(hào)時(shí)長(zhǎng)大約為8 min，心肌鈣蛋白I的理論最低檢測(cè)濃度為 0.4 ng/mL。整個(gè)芯片的制造與發(fā)展成熟的微加工技術(shù)相兼容，因此可以低成本批量化生產(chǎn)，這對(duì)于此類疾病的快速診斷具有重要意義。