張曼君，李小敏，張燕鵬,*，齊玉堂，張維農(nóng)，胥 偉

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430023）

米糠作為水稻加工過程中的主要副產(chǎn)物，含有豐富的膳食纖維、功能性油脂、蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，是一種極具開發(fā)潛力的高附加值資源[1]。米糠蛋白在米糠中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%～16%，具有良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其必需氨基酸組成齊全，氨基酸配比合理平衡，接近于聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織推薦模式，并且具有消化率高和低過敏性的優(yōu)點(diǎn)[2-3]。因此米糠蛋白是一種高品質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源，特別適合被開發(fā)應(yīng)用于嬰幼兒和特殊人群營(yíng)養(yǎng)配方食品中[4]。

米糠蛋白具有良好的功能特性，研究發(fā)現(xiàn)其起泡特性與蛋清蛋白相近[5]，因此可被當(dāng)作發(fā)泡劑而應(yīng)用于泡沫類型食品的加工中，如攪打奶油、充氣糖果、慕斯、奶昔、冰淇淋、蛋糕、面包、發(fā)泡酸乳飲料等，從而利用形成的微細(xì)泡沫賦予食品體系良好的質(zhì)構(gòu)特征與口感，使食品具有質(zhì)地均勻細(xì)膩、潤(rùn)滑的良好品質(zhì)[6-7]。已有研究表明，蛋白質(zhì)的起泡特性不僅取決于本身的結(jié)構(gòu)特征，界面性質(zhì)、兩親電荷分布及表面疏水性等物化性質(zhì)[8]，同時(shí)也受體系pH值、離子強(qiáng)度以及其他蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性吸附等因素的影響[9]。

目前鮮見有關(guān)對(duì)米糠蛋白起泡特性的系統(tǒng)研究，因此通過研究分析不同pH值和NaCl濃度體系下米糠蛋白的起泡特性和氣泡的微觀形態(tài)并闡述二者之間的相互關(guān)系，對(duì)促進(jìn)米糠蛋白起泡特性的基礎(chǔ)理論研究和構(gòu)建具有不同質(zhì)構(gòu)的米糠蛋白泡沫類食品體系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠蛋白（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)84.9%）由實(shí)驗(yàn)室自制；羅丹明B 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SorvallRC6Plus型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific公司；FiveEasy實(shí)驗(yàn)pH計(jì) 瑞士Mettle Toledo公司；Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；KND-103F自動(dòng)定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；手持式30631型電動(dòng)打蛋器 日本ECHO公司；FV1200激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白制備

取新鮮米糠用高速粉碎機(jī)粉碎后過60 目篩，按料液比1∶5（g/mL）與正己烷混合后在55 ℃條件下反復(fù)萃取5 次（殘油含量小于1%）后可獲得脫脂米糠粉。取脫脂米糠粉以料液比1∶10（g/mL）與蒸餾水混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為9.0，在55 ℃條件下攪拌浸提2 h后，25 ℃、10 000 r/min離心15 min獲得上清液。用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液的pH值至4.5并靜置2 h，然后20 ℃、8 000 r/min 離心15 min棄去上清液得到蛋白質(zhì)沉淀。蛋白質(zhì)用去離子水洗滌3 次后攪拌并調(diào)節(jié)pH值為7.0進(jìn)行復(fù)溶，經(jīng)冷凍干燥后制得米糠蛋白并于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取部分米糠蛋白樣品使用mico-Kjeldahl法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 米糠蛋白起泡特性測(cè)定

參考Zou Yuan[10]和Dhayal[11]等的方法，并作一定修改。考察pH值、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH-NaCl組合條件下對(duì)米糠蛋白起泡特性的影響。

pH值：將蛋白質(zhì)以5 mg/mL的質(zhì)量濃度分散于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值分別為2、4、6、7、8、10、12，然后取30 mL蛋白質(zhì)溶液于特制帶刻度的試管（直徑4 cm，高10 cm）中，將電動(dòng)打蛋器深入到溶液中約1 cm處，攪拌15 s后，立即測(cè)量泡沫體積V0，靜置2 h后再次測(cè)定體積Vt。按公式（1）和（2）計(jì)算蛋白質(zhì)的起泡能力及泡沫穩(wěn)定性：

NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)：將蛋白質(zhì)以5 mg/mL的質(zhì)量濃度分散于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為7，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.25%、0.5%、1%、2% NaCl，然后起泡并按公式（1）和（2）計(jì)算起泡能力及泡沫穩(wěn)定性。

pH-NaCl組合：根據(jù)對(duì)單因素條件下起泡能力及泡沫穩(wěn)定性的分析，選取不同pH值、NaCl組合測(cè)定起泡特性。將蛋白質(zhì)以5 mg/mL分散于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值分別為2、4、7、12，再添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.25%、1% NaCl，然后起泡并按公式（1）和（2）計(jì)算起泡能力及泡沫穩(wěn)定性。

1.3.3 泡沫微觀形態(tài)分析

參考Sadahira[12]和Yang Xin[13]等的方法并稍作修改。取29.5 mL配制好的蛋白質(zhì)溶液，添加0.5 mL羅丹明B染液（1 mg/mL）使蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度為5 mg/mL，采用1.3.2節(jié)方法進(jìn)行起泡實(shí)驗(yàn)，起泡結(jié)束后立刻取樣于凹型載玻片，蓋上載玻片后在Olympus激光共聚焦顯微鏡觀察泡沫的微觀形態(tài)并進(jìn)行分析。激發(fā)波長(zhǎng)為543 nm，放大倍數(shù)為100 倍。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次后求平均值，采用Origin 8.5和SPSS分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析；通過采用Image Pro Plus圖片分析軟件對(duì)激光共聚焦圖片進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)米糠蛋白起泡特性的影響

如圖1所示，當(dāng)pH值為4時(shí)，米糠蛋白溶液的起泡能力最差（20±0）%，但具有較好的泡沫穩(wěn)定性（88.3±7.3）%，這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近時(shí)蛋白質(zhì)的溶解性較低，可溶性蛋白減少[14]，沉降蛋白質(zhì)較多，從而沒有足夠的蛋白質(zhì)吸附到界面[15]，使起泡能力降低。同時(shí)在等電點(diǎn)附近由于缺乏相互排斥作用，這有利于氣-液界面上蛋白質(zhì)之間的相互作用[16]，形成多層蛋白分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而增加界面膜的黏度[17-18]，從而有利于泡沫穩(wěn)定性的提高。當(dāng)pH值偏離米糠蛋白的等電點(diǎn)時(shí)，起泡能力會(huì)增加而泡沫穩(wěn)定性有所下降，尤其當(dāng)溶液的pH值為12時(shí)起泡能力增加最為顯著。這是因?yàn)楫?dāng)溶液的pH值偏離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的可解離基團(tuán)發(fā)生解離，增加蛋白質(zhì)所帶凈電荷量，導(dǎo)致分子間和分子內(nèi)的靜電排斥力增加，削弱了分子內(nèi)的疏水相互作用[19-20]，使得蛋白質(zhì)分子膨脹展開，柔性增加，從而有利于更快地吸附至界面而增強(qiáng)起泡能力[21-22]，但此時(shí)蛋白質(zhì)分子在界面由于靜電力的排斥相互作用，而使米糠蛋白無法形成較為緊密的界面膜，降低界面膜的黏彈性和機(jī)械性能而使泡沫穩(wěn)定性變差[23-24]。

圖1 pH值對(duì)米糠蛋白起泡特性的影響Fig. 1 Effect of pH on foaming properties of rice bran protein

2.2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)米糠蛋白起泡特性的影響

圖2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)米糠蛋白起泡特性的影響Fig. 2 Effect of NaCl concentration on foaming properties of rice bran protein

如圖2所示，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加有利于提高米糠蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性，特別是當(dāng)pH 7、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)米糠蛋白的起泡能力與泡沫穩(wěn)定性均可達(dá)到較大值，分別為（90.0±5.8）%和（84.6±0）%，這表明此時(shí)米糠蛋白的分子結(jié)構(gòu)與理化特性保持了較好的平衡狀態(tài)，以保證可同時(shí)具有較好的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性。已有研究發(fā)現(xiàn)，NaCl可通過非特異性的靜電作用與蛋白質(zhì)分子發(fā)生相互作用而改變其所帶凈電荷量，并影響蛋白質(zhì)分子的展開和聚集狀態(tài)及水合作用[25]。因此當(dāng)離子濃度較低時(shí)，由于“鹽溶”效應(yīng)使蛋白質(zhì)的溶解度增加從而使起泡能力提高[26]；當(dāng)離子濃度過高時(shí)，會(huì)影響蛋白質(zhì)分子的水合作用而可能使部分蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，從而使起泡能力有所降低[27]。同時(shí)由于鹽離子對(duì)蛋白質(zhì)分子電荷的中和作用，有利于加速蛋白質(zhì)分子在膜界面的吸附及擴(kuò)散[28]，并使其在界面的靜電排斥作用減弱，分子間的相互作用增強(qiáng)而易于形成黏彈性和機(jī)械性質(zhì)較好的界面膜，從而有利于泡沫穩(wěn)定性的增強(qiáng)[29]。

2.3 pH-NaCl組合條件下米糠蛋白的起泡特性

圖3 pH-NaCl組合對(duì)米糠蛋白起泡能力（A）和泡沫穩(wěn)定性（B）的影響Fig. 3 Effect of pH and NaCl combinations on foaming capacity (A)and foam stability (B) of rice bran protein

由圖3A可知，在不同pH值條件下添加NaCl后均對(duì)米糠蛋白的起泡能力有所改善，其中當(dāng)pH值分別為2、4、7時(shí)米糠蛋白的起泡能力隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而升高，并且當(dāng)NaCl添加量為1%時(shí)，起泡能力改善最為顯著；而在pH值為12，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%時(shí)米糠蛋白的起泡性達(dá)到最大值（196.7±5.8）%。如圖3B所示，只有當(dāng)米糠蛋白溶液的pH值為7時(shí)，添加NaCl可提高米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性，而當(dāng)pH值為2、4和12時(shí)，NaCl的添加泡沫穩(wěn)定性無顯著改善，甚至?xí)档兔卓返鞍椎呐菽€(wěn)定性，這也說明與NaCl相比，pH值對(duì)米糠蛋白泡沫穩(wěn)定性的改善更為顯著。

2.4 泡沫微觀形態(tài)分析

通過采用激光共聚焦顯微鏡觀察分析氣泡的大小與數(shù)量等幾何動(dòng)態(tài)變化特性，可一定程度上從微觀的角度反映米糠蛋白的起泡特性[13,30]，因此根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取pH值分別為2、4、7、12與NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%和1%的組合條件下的米糠蛋白泡沫進(jìn)行微觀形態(tài)的觀察。

圖4 激光共聚焦顯微掃描圖片F(xiàn)ig. 4 Confocal laser scanning microscope (CLSM) images

如圖4所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，氣泡的數(shù)量由于空氣的擴(kuò)散瀝水、凝集及歧化等反應(yīng)而減少[31]，進(jìn)一步對(duì)起泡初始階段的氣泡直徑分布頻率直方圖（圖5）分析可知，在不添加NaCl的情況下，與其他pH值相比，米糠蛋白溶液的pH值為4時(shí)氣泡直徑的分布范圍較窄也較為均勻，因此可以避免由于小氣泡中的氣壓小于大氣泡而發(fā)生歧化反應(yīng)，這在一定程度上有利于泡沫的穩(wěn)定性[12]；相比當(dāng)米糠蛋白溶液pH值為2時(shí)，因所形成的泡沫中含有較多直徑較大的氣泡，則易發(fā)生歧化反應(yīng)，因此泡沫穩(wěn)定性較差（圖1）[13,30]。另外由圖4可知，當(dāng)pH值為4時(shí)，米糠蛋白在連續(xù)相中的分布并不均勻，傾向于在氣泡表面聚集，這就易于形成較為黏稠的界面膜，從而有利于泡沫的穩(wěn)定性[23]。當(dāng)米糠蛋白溶液中添加一定量的NaCl時(shí)，由圖5可知，在pH值為2的情況下，起始階段氣泡的平均直徑（d32）顯著減小，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)氣泡發(fā)生了明顯的歧化和凝聚反應(yīng)，這說明NaCl的添加可能屏蔽了蛋白質(zhì)表面部分正電荷而有利于加速米糠蛋白在氣-液界面的吸附和擴(kuò)散以改善起泡能力[9]，但并不利于泡沫穩(wěn)定性。在其他pH值條件下添加NaCl后氣泡平均直徑（d32）則均有一定程度的升高。

圖5 CLSM圖片初始時(shí)刻（0 min）氣泡直徑分布頻率直方圖Fig. 5 Histograms of distribution frequency of bubble diameter in CLSM images (0 min)

為了進(jìn)一步說明不同反應(yīng)體系下米糠蛋白起泡特性和氣泡的微觀形態(tài)，對(duì)氣泡的平均面積與數(shù)量隨時(shí)間的變化規(guī)律進(jìn)行分析，如圖6所示。與未添加NaCl的米糠蛋白溶液相比，添加NaCl后當(dāng)pH值為2和4時(shí)，初始階段氣泡平均面積相差不大，但氣泡的數(shù)量增加明顯；而當(dāng)pH值為7和12時(shí)，初始階段氣泡數(shù)量相差不大，但氣泡的平均面積增加，因此這二者的綜合效應(yīng)從宏觀上表現(xiàn)為NaCl的添加可改善米糠蛋白的起泡能力（圖3A）。另外結(jié)合氣泡數(shù)量的變化速率分析可知，在30 min內(nèi)，在pH 2、4和12條件下添加NaCl后米糠蛋白的起泡數(shù)量減少的速率明顯增加，這表明NaCl的加入對(duì)泡沫的穩(wěn)定性沒有明顯改善作用（圖4），而對(duì)于在pH值為7的情況下，添加NaCl后在前10 min內(nèi)氣泡數(shù)量降低的速率較高，然后速率有所降低，同時(shí)30 min后與未添加NaCl的米糠蛋白溶液相比，氣泡的平均面積較大，因此雖然氣泡的數(shù)量較少，但在宏觀形態(tài)上與對(duì)照樣品相比，泡沫體積的穩(wěn)定性并未降低（起泡30 min后二者的泡沫穩(wěn)定性分別為pH 7、0% NaCl：（89.4±4.1）%和pH 7、1% NaCl：（91.7±1.8）%）。因此基于對(duì)米糠蛋白泡沫的微觀形態(tài)的動(dòng)態(tài)分析說明，在利用蛋白質(zhì)泡沫改善食品品質(zhì)時(shí)一方面要考慮泡沫的穩(wěn)定性，同時(shí)也要考慮到氣泡的微觀形態(tài)，以便制備出具有符合最佳感官體驗(yàn)的產(chǎn)品[32]。

圖6 氣泡平均面積和氣泡數(shù)量隨觀察時(shí)間變化Fig. 6 Changes in mean bubble area and bubble count per area in CLSM images from 0 to 30 min

3 結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)分析pH值和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)米糠蛋白起泡特性的影響。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值為4時(shí)，米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性可達(dá)最大值（88.3±7.3）%，而當(dāng)溶液pH值偏離4時(shí)，泡沫穩(wěn)定性降低但起泡能力增加，在pH 2和12條件下起泡能力可分別提高至（98.3±4.4）%和（168.9±10.2）%。另外在pH 7條件下添加1%的NaCl后，米糠蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性可分別提高至（90.0±5.8）%和（84.6±0）%。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)研究不同pH值和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)組合條件下米糠蛋白起泡特性。研究結(jié)果表明，在pH 2、4、7和12條件下，添加NaCl均可顯著提高米糠蛋白溶液的起泡能力，但僅在pH值為7的情況下添加NaCl可改善泡沫穩(wěn)定性。

通過對(duì)不同環(huán)境因素條件下米糠蛋白泡沫微觀形態(tài)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，起始階段泡沫直徑的大小和分布均可影響泡沫體系的歧化反應(yīng)進(jìn)而影響米糠蛋白溶液的起泡能力與泡沫穩(wěn)定性；另外通過對(duì)氣泡平均面積與數(shù)量隨時(shí)間的變化規(guī)律分析可知，米糠蛋白溶液的宏觀泡沫穩(wěn)定性與二者的綜合效應(yīng)有關(guān)。因此在實(shí)際應(yīng)用中可通過對(duì)環(huán)境因素的調(diào)控來控制起泡的微觀形態(tài)以滿足產(chǎn)品的品質(zhì)要求。