石 林，吳 瑗，巴少波，劉正奎，陳 琳，王 磊，邵春艷，孫 靜，周瑩姍，王曉杜，宋厚輝

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院，浙江 杭州311300；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，浙江金華 321007）

豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）是引起豬Sus scrofa圓環(huán)病毒相關(guān)綜合征（PCVAD）的主要病原體之一，主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、母豬繁殖障礙、豬呼吸道疾病綜合癥（PRDC）、豬皮炎與豬腎病綜合癥（PDNS）、腸炎和先天性震顫等疾?。?－2］。PCV2對外界和一般消毒劑的抵抗力較強(qiáng)，在酸性環(huán)境及氯仿中可以存活較長時間甚至在高溫環(huán)境（72℃）也能存活一段時間。PCV2易通過胎盤垂直傳播，感染豬群的免疫功能下降后發(fā)病，常與豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）或豬細(xì)小病毒（PPV）混合感染，也易繼發(fā)豬副嗜血桿菌或豬鏈球菌2型感染［3］。PCV2主要感染哺乳期和育成期的仔豬，尤其5～12周齡仔豬特別易感，常并發(fā)或繼發(fā)細(xì)菌感染而導(dǎo)致死亡率大大增加［4］。PCV2最早發(fā)現(xiàn)于加拿大，后蔓延至美國、西班牙、英國、丹麥、德國、荷蘭、比利時、日本和韓國等，發(fā)病率為10%～80%，死亡率為15%～30%［5］。PCV2在中國豬群中早已存在，2002年后發(fā)病豬群逐漸增多，死亡率為20%～30%［6－7］。臨床上防控該病主要采用疫苗接種方法，雖然控制了大規(guī)模流行的趨勢，但是一些飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)酿B(yǎng)殖場仍然存在較高的發(fā)病率。為及時診斷該疾病，及早接種疫苗和加強(qiáng)生物安全措施，亟需建立起一種高靈敏性、快速高效的檢測方法，以減少疾病所導(dǎo)致的損失。實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)是一種簡單、快速、靈敏度高的檢測技術(shù)，應(yīng)用到動物疫病診斷上，主要采用基于SYBR Green I和Taqman探針的2種熒光定量檢測方法，相比而言，Taqman探針靈敏性更高。因此，本研究擬利用針對PCV2的ORF1基因特異引物和TaqMan探針，建立一種實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)，為PCV2的實(shí)驗室診斷和疫病預(yù)警預(yù)報提供檢測工具。

1 材料和方法

1.1 病毒

豬圓環(huán)病毒（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）均由浙江農(nóng)林大學(xué)動物預(yù)防醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生實(shí)驗室保存，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）-豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）-輪狀病毒（RV）三聯(lián)疫苗購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 引物與探針的設(shè)計 從GenBank中下載PCV2特異性的ORF1基因（Genbank：MF616438.1）序列，利用Beacon Designer 7軟件找出該基因上的高保守序列，設(shè)計1對特異引物和1條帶有FAM（6-羧基熒光素）標(biāo)記和碎滅為MGB（Minor Groove Binder，小溝結(jié)合物）的Taqman探針。上游引物（ORF1-F）序列：5′-TAGATCTCAAGGACAACGGAGTGA-3′； 下游引物（ORF1-R）序列：5′-GTTACAGGGTGCTGCTCTGCA-3′；探針序列：5′-FAM-CAGACTCCCGCTCTC-MGB-NFQ-3′。所有序列均由上海金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 應(yīng)用特異引物（ORF1-F/R），以PCV2的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃ 5 min；98℃ 10 s，60℃30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃ 10 min，15℃ 5 min。利用DNA凝膠回收試劑盒（上海生工生物有限公司）純化回收PCR產(chǎn)物，連接至pMD18-T（大連寶生物工程有限公司）克隆載體后，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Escherichia coli（DH5α）感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)藍(lán)白斑篩選得到陽性克隆，用菌落PCR和質(zhì)粒PCR鑒定獲得陽性重組質(zhì)粒（命名為pSL1353），送生物公司（上海金唯智生物科技有限公司）測序驗證。所獲質(zhì)粒經(jīng)核酸蛋白濃度測定儀測定濃度和純度，置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 配制實(shí)時熒光定量PCR的反應(yīng)體系，其中上、下游引物各0.4 μL， SYBRPremix EXTaq10.0 μL， 模板（pSL1353） 2.0 μL， 超純水補(bǔ)足至 20.0 μL。 對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)置退火溫度為54，56，58，60和62℃，以獲得該方法的最佳退火溫度。分別采用0.2，0.3，0.4和0.5 μmol·L－1的引物濃度，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，確定該方法的最佳引物濃度。采用0.1， 0.2， 0.3， 0.4 和 0.5 μmol·L－1的探針濃度， 上、 下游引物各 0.4 μL， rTaq酶和 dNTP 混合物 10.0μL，模板（pSL1353，超純水為空白對照）2.0 μL，超純水補(bǔ)足至20.0 μL，確定最佳Taqman探針濃度。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及線性范圍 將1.2.2得到的pSL1353質(zhì)粒以10倍梯度稀釋成 1013， 1012， 1011， 1010， 109， 108， 107和 106拷貝·L－1； 以 1.2.3 得到的優(yōu)化條件進(jìn)行熒光定量 PCR擴(kuò)增，重復(fù)3次·濃度－1；以陽性重組質(zhì)?？截悢?shù)為橫坐標(biāo)，以各濃度下的循環(huán)數(shù)（Ct）值為縱坐標(biāo)，建立Taqman探針實(shí)時熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線。 其中拷貝數(shù)計算公式： 拷貝數(shù)（拷貝·L－1）＝質(zhì)粒濃度（g·L－1）×阿弗加德羅常數(shù)/重組質(zhì)粒分子量［8］。

1.2.5 實(shí)時熒光定量 PCR敏感性試驗 將 pSL1353質(zhì)粒稀釋成 1 000×106，100×106，50×106，20×106， 5×106和 106拷貝·L－1， 設(shè)置 6 重復(fù)·濃度－1， 測定各濃度下的循環(huán)數(shù)（Ct）， 用 PODLOD calculation program（version 8）［9］計算本檢測方法的最低檢測限值。

1.2.6 實(shí)時熒光定量PCR重復(fù)性試驗 以空白模板對照，檢測已知的PCV2 DNA樣品，間隔1周做重復(fù)試驗， 重復(fù) 3 次·樣品－1（組間）； 檢測已知的 3 個 PCV2 DNA 樣品（1013， 1012， 1011拷貝·L－1）， 重復(fù) 6個·樣品－1（組內(nèi)）。 計算組內(nèi)和組間變異系數(shù)（CV），驗證該方法的重復(fù)性。其中SCt為Ct的標(biāo)準(zhǔn)差，為Ct的平均值。

1.2.7 實(shí)時熒光定量PCR特異性試驗 以1.2.3建立的PCV2 Taqman探針實(shí)時熒光定量方法同時對CSFV，PRRSV，PEDV/TGEV/RV進(jìn)行檢測，以空白模板為對照，確定該方法的特異性。

1.2.8 臨床樣品的檢測 以1.2.3建立的PCV2 Taqman探針實(shí)時熒光定量方法檢測2016－2017年杭州市周邊地區(qū)規(guī)?；i養(yǎng)殖場送檢的50份疑似病料（腹股溝淋巴結(jié)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以PCV2疫苗毒株所提取的DNA為模板，利用特異性引物（ORF1-F/R）擴(kuò)增出大小約100 bp的片段；擴(kuò)增產(chǎn)物回收后借助T/A克隆技術(shù)，構(gòu)建pMD18-T-PCV2-ORF1載體（pSL1353），經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒PCR鑒定為陽性克隆（圖1）。測序驗證其序列，發(fā)現(xiàn)與NCBI上PCV2的序列（GenBank：KY940521.1）同源性達(dá) 100%。提取pSL1353質(zhì)粒作為本研究方法的陽性質(zhì)控，可以作為判斷試驗成立與否的陽性模板。

2.2 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序的優(yōu)化

依據(jù)1.2.3，發(fā)現(xiàn)退火溫度為60℃時擴(kuò)增效率最高。在PCV2質(zhì)粒濃度1013拷貝·L－1時進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化，根據(jù)有典型擴(kuò)增曲線且Ct值最小的原則， 發(fā)現(xiàn)上、 下游引物濃度 0.2 μmol·L－1（圖 2A）和探針濃度 0.2 μmol·L－1（圖 2B）時擴(kuò)增效果最佳。 該結(jié)果可作為試劑盒開發(fā)及成本控制的理論依據(jù)。

圖1 陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的PCR鑒定Figure 1 Identification of positive standard plasmids by PCR

2.3 實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將稀釋（1013， 1012， 1011， 1010， 109， 108， 107， 106拷貝·L－1）后的重組質(zhì)粒作為模板， 在 2.2 的 Taqman探針實(shí)時熒光定量PCR優(yōu)化條件下進(jìn)行擴(kuò)增（圖3A），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3B所示，其線性回歸方程為Ct＝－0.671 4×lgA＋38.16，其中A為模板濃度。相關(guān)系數(shù)（R2）為0.974 5，表明本研究所建立的方法在模板為2.1×1013～2.1×106拷貝·L－1時，檢測到Ct值和模板之間具有較好的線性關(guān)系。

2.4 實(shí)時熒光定量PCR的重復(fù)性

選取2.3中1013，1012，1011拷貝·L－1陽性質(zhì)粒為模板，在2.2優(yōu)化條件下進(jìn)行重復(fù)試驗。結(jié)果表明：組內(nèi)樣品擴(kuò)增曲線重復(fù)性較好（圖4），組內(nèi)與組間Ct值的變異系數(shù)較?。ū?）,表明該檢測方法有較好的重復(fù)性。

圖2 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化Figure 2 Optimized system and conditions of reaction of PCV2

圖3 實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Figure 3 Standard curve of the real-time quantitative PCR of PCV2

2.5 實(shí)時熒光定量PCR的靈敏性

陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 pSL353分別按照 1 000×106，100×106， 50×106， 20×106， 5×106和 106拷貝·L－1， 重復(fù) 6 次·濃度－1，進(jìn)行實(shí)時熒光定量 PCR擴(kuò)增，有典型的擴(kuò)增曲線且Ct值小于38時判斷為陽性。結(jié)果表明：每個濃度均具有較好的重復(fù)（圖5）。PODLOD V8軟件［9］公式計算，得到該方法的最低檢測線為 8.828×106拷貝·L－1（95%的檢測限）（表 2）。

圖4 PCV2實(shí)時熒光定量PCR重復(fù)性試驗擴(kuò)增曲線Figure 4 Amplification curve of repetitive assay PCV2

2.6 實(shí)時熒光定量PCR的特異性

分別以 PCV2的基因組 DNA，PEDV，TGEV，PEDV/TGEV/RV三聯(lián)疫苗的cDNA為模板，利用1.2.3構(gòu)建的檢測方法進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明：PCV2病毒組有特征性擴(kuò)增曲線，其他各組則沒有，說明該方法具有較好的特異性（圖6），為臨床疾病混合感染情況下準(zhǔn)確檢測PCV2提供了工具。

表1 實(shí)時熒光定量PCR的重復(fù)性驗證Table 1 Repetitive assay of the real-time quantitative PCR

2.7 臨床樣品的檢測

以實(shí)驗室收集到的2016－2017年杭州市周邊地區(qū)規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場的50份PCV2疑似病料（腹股溝淋巴結(jié)）為檢測樣本，提取樣本中的DNA，利用本研究的PCV2實(shí)時熒光定量PCR檢測方法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：送檢50份樣品中該方法檢出40份陽性，待檢樣品的PCV2陽性率達(dá)80%（表3），與普通PCR檢測結(jié)果基本一致。

圖5 PCV2的實(shí)時熒光定量PCR靈敏性擴(kuò)增曲線Figure 5 Amplification curve of sensitivity assay of PCV2

圖6 實(shí)時熒光定量PCR方法特異性擴(kuò)增曲線Figure 6 Amplification curve of specificity analysis

3 討論

PCV2是目前規(guī)?；i場疾病防控中最重要的病原體之一，通常伴隨細(xì)菌感染［10］，因此要檢定出PCV2，需要建立高度靈敏的檢測方法。YANG等［11］建立的基于SYBR Green I檢測 PCV2 的方法檢測范圍是 109～1017拷貝·L－1， 鄭蘭蘭等［12］建立的PCV2和PRV二重SYBR Green I熒光定量PCR方法對PCV2的檢測靈敏度是215×106拷貝·L－1；本研究建立的方法能檢測PCV2病毒基因組DNA最低濃度達(dá)到為8.825×106拷貝·L－1，比常規(guī)PCR和基于SYBR Green I的熒光定量PCR更加靈敏。影響實(shí)時熒光定量PCR方法的靈敏度涉及許多因素，如樣品來源的復(fù)雜程度，引物和探針特異性，體系及擴(kuò)增條件等，其中引物和探針的設(shè)計是最重要的關(guān)鍵點(diǎn)。SYBR Green I法是基于熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合后檢測熒光值來判斷產(chǎn)物的量，而Taqman探針法則是基于DNA酶的5′外切酶活性對探針的切割后，熒光信號的強(qiáng)弱判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的量，因而探針的特異結(jié)合使得該方法具有更高的特異性。本研究針對PCV2的ORF1保守區(qū)域設(shè)計特異引物，有利于擴(kuò)增PCV2所有基因型的毒株，其探針則是基于15堿基的特異序列，具有較高結(jié)合效率；普通Taqman探針一般為25～35 bp， 而MGB探針由于在普通Taqman 3′端特殊的設(shè)計，長度更短，一般為10到15 bp，因而靈敏性更高，同時還具有淬滅無熒光、背景低等特點(diǎn)。所以本研究采用的淬滅基團(tuán)為MGB的Taqman探針，提高了檢測靈敏度，降低了背景值。

表2 實(shí)時熒光定量PCR的靈敏度Table 2 Sensitivity of the real-time quantitative PCR

表3 實(shí)時熒光定量PCR方法檢測臨床樣品PCV2的結(jié)果Table 3 Results of detecting PCV2 from clinical samples by fluorescent quantitative PCR

基于ORF2（Cap）基因分類方法，分子流行病學(xué)分析認(rèn)為PCV2在臨床上流行主要為 PCV2a，PCV2b 2個基因型［13］，且后者的流行明顯超過前者；近期發(fā)現(xiàn)還存在PCV2c，2d，2e等基因型［14－15］。本研究在設(shè)計引物時針對相對保守的ORF1（Rep）基因，因此能夠檢測PCV2的所有基因型，為臨床診斷提供了可靠的檢測工具。