李飛鴻，侯應(yīng)軍，李雪涵，余心怡，渠慎春

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蘋果赤霉素氧化酶基因的克隆及功能分析

李飛鴻，侯應(yīng)軍，李雪涵，余心怡，渠慎春

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095）

【目的】從‘蘇帥’蘋果（）中分離克隆赤霉素氧化酶基因的開放閱讀框（ORF），分析其序列特征及在蘋果中的組織表達(dá)特異性，通過在煙草中過表達(dá)研究其對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為該基因功能分析及應(yīng)用提供理論參考?！痉椒ā坎捎肦T-PCR方法從蘋果中克隆出的ORF區(qū)。利用NCBI、DNAMAN和Pfam在線軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析；利用Expasy在線軟件對(duì)氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)進(jìn)行分析；利用SignalP和TMHMM Server V.2.0分別在線分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測(cè)在蘋果不同組織中的表達(dá)量。構(gòu)建過表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將導(dǎo)入煙草中，獲得具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因煙草植株，通過GUS染色、基因組PCR和RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株；將野生型和轉(zhuǎn)基因煙草移栽后，在第一朵花開放時(shí)測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草的株高、節(jié)間長(zhǎng)度和葉片長(zhǎng)寬比以及煙草葉片葉綠素含量，激素GA1和GA4含量，并通過RT-qPCR方法分析煙草中相關(guān)基因的表達(dá)水平。【結(jié)果】成功克隆并獲得了長(zhǎng)為1 122 bp的ORF區(qū)，編碼373個(gè)氨基酸殘基，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為42.8 kD，理論等電點(diǎn)為5.44，不穩(wěn)定系數(shù)為49.73，具有GA2ox的保守結(jié)構(gòu)域DIOX_N和20G-Fell_Oxy，但無明顯疏水區(qū)，無跨膜區(qū)，無信號(hào)肽，為非分泌蛋白。序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示MdGA2ox8與白梨GA2ox8親緣關(guān)系最近。RT-qPCR結(jié)果表明，在蘋果各組織中差異表達(dá)，在花中的表達(dá)量最高，其次為老葉＞幼葉＞韌皮部，在木質(zhì)部和幼果中幾乎不表達(dá)。將轉(zhuǎn)入模式植物煙草中，獲得了5個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性株系。與野生型相比，過表達(dá)煙草植株GA4含量降低，GA1含量有所升高，其中野生型和轉(zhuǎn)基因煙草GA1平均含量分別為1.26和1.75 ng·g-1，GA4平均含量分別為5.43和1.07 ng·g-1。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草植株GA1和GA4總含量降低，使植株節(jié)間縮短、矮化以及花期推遲，其中野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株平均高度分別為38.50和7.36 cm，節(jié)間長(zhǎng)度分別為9.5和3.3 cm；轉(zhuǎn)基因煙草葉片顏色深綠，葉片長(zhǎng)寬比降低。煙草內(nèi)源赤霉素合成途徑相關(guān)基因和的表達(dá)水平受的正反饋調(diào)節(jié)。【結(jié)論】獲得蘋果赤霉素氧化酶基因的開放閱讀框，具有組織表達(dá)差異性。過表達(dá)煙草植株中GA1和GA4總含量降低，導(dǎo)致植株節(jié)間長(zhǎng)度縮短、植株矮化。

蘋果；赤霉素氧化酶；矮化；；過表達(dá)；煙草

0 引言

【研究意義】蘋果（）是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的果樹之一。矮化栽培現(xiàn)已成為世界蘋果栽培最主要的高效栽培模式，此栽培模式近幾年在我國發(fā)展迅速，主要通過矮化砧木實(shí)現(xiàn)?！K帥’是由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)通過雜交培育的短枝型蘋果品種[1]，以此品種為材料，克隆赤霉素代謝關(guān)鍵酶基因，通過研究其表達(dá)模式及功能，探討其節(jié)間縮短的主要機(jī)理，對(duì)果樹矮化和短枝形成機(jī)制的研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在植物體內(nèi)，具有生物活性的GA有GA1、GA3、GA4和GA7[2]。GA20-氧化酶（GA20ox）、GA3-氧化酶（GA3ox）和GA2-氧化酶（GA2ox）是參與植物赤霉素合成與代謝的關(guān)鍵酶，其中GA20ox和GA3ox參與GA合成，而GA2ox則參與GA的分解代謝[2]。GA2ox是由多基因家族編碼的雙加氧酶，是赤霉素代謝過程中關(guān)鍵酶之一，作用于有生物活性的GA1和GA4，分別將它們轉(zhuǎn)變成無活性的分解代謝物GA8和GA34，使植物體內(nèi)GA的活性降低，維持植物體內(nèi)生物活性GA和無活性GA的平衡[3]。研究表明，沉默可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)和纖維的產(chǎn)生[4]，而過表達(dá)則可以導(dǎo)致植株赤霉素含量的減少和矮化[5]。目前，已經(jīng)從擬南芥[6]、水稻[7]、梨[8-9]、葡萄[10]、馬鈴薯[11]、西洋參[12]、太子參[13]、柳枝稷[14]、山茶[15]、油菜[16]中克隆得到。【本研究切入點(diǎn)】迄今，有關(guān)蘋果赤霉素合成相關(guān)基因克隆的研究?jī)H見少量報(bào)道[17-20]，而對(duì)蘋果的分離及功能研究尚未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用RT-PCR技術(shù)克隆的開放閱讀框（ORF），分析其組織特異性，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其序列進(jìn)行分析，構(gòu)建過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草，分析過表達(dá)對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響，為果樹矮化機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料‘蘇帥’由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)以‘印度’蘋果為母本、‘金帥’為父本雜交育成，2011年通過江蘇省作物品種審定委員會(huì)鑒定（蘇鑒果201108）。該品種植株生長(zhǎng)健壯，樹冠緊湊，枝條粗壯，具有典型的短枝型蘋果品種特征[1]。本研究所用‘蘇帥’苗為八棱海棠作為砧木的3年生盆栽苗，所用基質(zhì)為泥炭土，株高160 cm，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。于2016年6月取‘蘇帥’中枝頂端展葉2周的幼葉，液氮速凍后于-70℃保存?zhèn)溆?；煙草K326種子由玉溪中煙種子有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 菌株與試劑 大腸桿菌菌株DH5、農(nóng)桿菌菌株EHA105均購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司。各種限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自TaKaRa公司。pEASY-Blunt克隆載體購自TransGen Biotech、植物RNA提取試劑盒購自成都福際生物技術(shù)有限公司。GA1標(biāo)準(zhǔn)樣品和GA4標(biāo)準(zhǔn)樣品均購自Sigma公司，色譜級(jí)甲醇購自Tedia公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1根據(jù)先前研究結(jié)果[21]，‘蘇帥’蘋果中基因MDP0000309451可能與其節(jié)間較短的表型相關(guān)，參照NCBI GenBank中蘋果基因序列，采用Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物序列（表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 蘋果MdGA2ox8克隆、表達(dá)及功能分析所用引物

以‘蘇帥’中枝頂端展葉2周的幼嫩葉片為材料提取總RNA及反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，引物-F1和-R1用于ORF克隆。PCR反應(yīng)體系：模板（cDNA）1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上下游引物各0.75 μL，1.0 μL PrimeSTAR GXL酶，用超純水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序：98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，68℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min，4℃保存。產(chǎn)物回收：PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照，按照膠回收試劑盒說明書的步驟進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。產(chǎn)物的連接轉(zhuǎn)化：將回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt克隆載體相連接，步驟如下：（1）連接：PCR產(chǎn)物3 μL，pEASY-Blunt克隆載體1 μL，總體積4 μL，25℃反應(yīng)15 min；（2）轉(zhuǎn)化：取-70℃保存的大腸桿菌DH5，冰上融化，至半融化狀態(tài)時(shí)加入4 μL的連接產(chǎn)物，輕彈混勻，冰浴20—30 min，42℃熱激30 s，立即放于冰上2 min，在超凈工作臺(tái)中加入250 μL的無抗性的LB液體培養(yǎng)基，200 r/min，37℃搖菌培養(yǎng)1 h；（3）涂板：離心后去上清液，留取100 μL菌液均勻涂于50 mg·L-1Km抗性的平板上，37℃培養(yǎng)8—12 h；（4）陽性克隆檢測(cè)：挑取白色單菌落，接種在含有50 mg·L-1Km的LB液體培養(yǎng)基中，250 r/min，37℃搖菌培養(yǎng)4 h，PCR檢測(cè)陽性克隆，測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2序列分析 將測(cè)序驗(yàn)證正確的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列分別在NCBI數(shù)據(jù)庫上用BLASTn和BLASTp進(jìn)行序列相似性分析；通過ExPASy Proteomics Server的在線軟件Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)的分析和預(yù)測(cè)，應(yīng)用ProtScale（https://web.expasy. org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的疏水性；利用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）在線分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；應(yīng)用TMHMM Server V.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；下載可可（）、擬南芥（）、大豆（）、玉米（）、葡萄（）、白梨（）、草莓（subsp.）、煙草（）、甜菜（subsp.）9個(gè)物種的氨基酸序列，使用Pfam（http://pfam.xfam.org/search# searchSequenceBlock）和DNAMAN對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析和比對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育樹使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建[22]。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 含酶切位點(diǎn)產(chǎn)物的擴(kuò)增：設(shè)計(jì)引物-F2和-R2，以測(cè)序正確的pEASY-質(zhì)粒為模板，-F2和-R2引物擴(kuò)增含Ⅰ和HⅠ酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，PCR反應(yīng)體系：模板（pEASY-質(zhì)粒）0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.75 μL（100 ng·μL-1），PrimeSTAR GXL酶1 μL，用超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR程序：98℃ 3 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物回收：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照，按照膠回收試劑盒說明書的步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收。PCR產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化：將回收產(chǎn)物連接pEASY-Blunt克隆載體，步驟同1.2.1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，PCR檢測(cè)陽性克隆，測(cè)序驗(yàn)證。

雙酶切：將測(cè)序正確的陽性菌液提取質(zhì)粒，構(gòu)建pCAMBIA1301-35SN-載體，步驟如下：（1）雙酶切體系：HⅠ 2 μL，Ⅰ 2 μL，10×K Buffer 2 μL，質(zhì)粒（分別為pCAMBIA1301-35SN-或pCAMBIA1301-35SN空載）7 μL，ddH2O補(bǔ)足至40 μL，37℃反應(yīng)3 h；（2）連接：將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收酶切后的目的基因和空載片段，連接體系：T4DNA連接酶0.5 μL，Ligase 10×Buffer 1 μL，pCAMBIA1301-35SN載體回收片段3.5 μL，目的基因5 μL，總體系10 μL，于16℃反應(yīng)1 h；（3）轉(zhuǎn)化和涂板：同1.2.1節(jié)；（4）陽性克隆檢測(cè)：挑取白色單菌落，接種在含有50 mg·L-1Km的LB液體培養(yǎng)基中，250 r/min，37℃搖菌培養(yǎng)4 h，用-F2和-R2引物進(jìn)行PCR檢測(cè)陽性克隆，送去測(cè)序驗(yàn)證；（5）將成功構(gòu)建的載體pCAMBIA1301-35SN-轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105菌株，具體步驟參照說明書。將PCR檢測(cè)陽性的菌液提取質(zhì)粒，并送公司測(cè)序。

1.2.4遺傳轉(zhuǎn)化煙草及其鑒定 采用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草K326[23-24]，其中篩選抗性標(biāo)記潮霉素（Hyg）的濃度為10 mg·L-1，每?jī)芍芨鼡Q一次培養(yǎng)基，以保持轉(zhuǎn)基因煙草的抗性篩選壓。轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定如下：首先剪取抗性煙草的葉片進(jìn)行GUS染色，對(duì)于GUS檢測(cè)呈藍(lán)色的植株，進(jìn)一步提取其DNA，利用基因特異引物-F1和-R1進(jìn)行PCR檢測(cè)。然后，提取PCR檢測(cè)陽性株系的葉片RNA（按照試劑盒說明書），反轉(zhuǎn)錄為cDNA，內(nèi)參檢測(cè)模板質(zhì)量，再以-F1和- R1為引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系：模板（cDNA）1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.15 μL，用超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5組織特異性表達(dá) 2018年4—5月取‘蘇帥’的花、幼葉、老葉、韌皮部、木質(zhì)部和幼果分別進(jìn)行檢測(cè)，上游引物-RT-F，下游引物-RT-R，作為內(nèi)參基因（表1）。每處理重復(fù)3次，根據(jù)2?ΔCt公式計(jì)算結(jié)果，通過SPSS軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差和差異顯著性。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 轉(zhuǎn)基因煙草和野生型各5株，經(jīng)煉苗后移栽，在第一朵花開放時(shí)進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定和取樣。測(cè)量煙草株高和節(jié)間長(zhǎng)度（從頂而下第3—13片葉的總節(jié)間長(zhǎng)度），測(cè)量從頂而下第4、5、6、7片葉的葉長(zhǎng)和葉寬，計(jì)算葉片的長(zhǎng)寬比。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量的測(cè)定 選取轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草的由頂而下第4、5片葉，參照李合生的丙酮乙醇（1﹕1）提取方法提取煙草葉片葉綠素[25]。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因煙草GA1、GA4含量的測(cè)定 選取轉(zhuǎn)基因株系、野生型煙草的由頂而下第4、5片葉，準(zhǔn)確稱量0.5 g。送南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司，采用ESI-HPLC-MS/MS方法檢測(cè)植物激素GA1、GA4的含量。

1.2.9 轉(zhuǎn)基因煙草中基因的表達(dá)分析 以作為內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR分析。通過NCBI設(shè)計(jì)特異引物：上游引物-RT-F和下游引物-RT-R，同時(shí)設(shè)計(jì)相關(guān)基因和的引物，分別為-RT-F，-RT-R和-RT-F，-RT-R。每處理重復(fù)3次，根據(jù)2?ΔΔCt公式計(jì)算結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析。利用Excel 2010和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果

2.1 MdGA2ox8獲得與序列分析

以‘蘇帥’葉片cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出一條1 000—2 000 bp的特異條帶（圖1-B）。經(jīng)產(chǎn)物回收、克隆、測(cè)序，該序列全長(zhǎng)為1 122 bp，編碼373個(gè)氨基酸。該基因已經(jīng)在GenBank登錄，登錄號(hào)為XM_008372903。運(yùn)用ExPASy Proteomics Server的在線軟件Protparam對(duì)MdGA2ox8蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)的分析和預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，其分子式為C1906H2959N507O573S19，相對(duì)分子質(zhì)量為42.8 kD，理論等電點(diǎn)5.44。其中負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為48，正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為39，脂肪系數(shù)為79.68，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為49.73，平均親水系數(shù)為-0.39，預(yù)測(cè)該蛋白為親水蛋白。預(yù)測(cè)MdGA2ox8蛋白無跨膜區(qū)，無信號(hào)肽序列，為非分泌蛋白。NCBI上分析氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)屬于PcbC superfamily超家族，有兩個(gè)比較保守的結(jié)構(gòu)域，分別是DIOX_N和2OG-FeII_Oxy保守結(jié)構(gòu)域。

將編碼的氨基酸序列在NCBI進(jìn)行搜索，下載白梨、葡萄、草莓、可可等9個(gè)物種的氨基酸序列與其進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)編碼的氨基酸序列與白梨、草莓和大豆具有較高的相似性，序列一致性分別為89.72%、70.34%和63.03%。多重序列比對(duì)結(jié)果表明這些所編碼的氨基酸序列均含有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為DIOX_N和2OG-FeII_Oxy（圖2）。為探討蘋果與其他植物之間的關(guān)系，選取相似性較高的10種植物的GA2ox蛋白氨基酸序列與MdGA2ox8蛋白氨基酸序列進(jìn)行比較分析，采用鄰位相連法繪制進(jìn)化樹。如圖3所示，蘋果編碼的氨基酸序列與白梨的氨基酸序列屬于同一個(gè)進(jìn)化支，親緣關(guān)系最近，然后與草莓聚為一支，再與他雙子葉、單子葉植物聚類。

紅色方框代表DIOX_N結(jié)構(gòu)域；黑色方框代表2OG-FeII_Oxy結(jié)構(gòu)域

圖3 不同物種GA2ox8的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 MdGA2ox8的組織表達(dá)

通過RT-qPCR方法檢測(cè)在蘋果不同組織中的表達(dá)（圖4），發(fā)現(xiàn)在花中的表達(dá)量最高，與其他組織的表達(dá)量差異顯著；其次為老葉、幼葉和韌皮部，但相互之間差異不顯著，而在幼果和木質(zhì)部的表達(dá)量最低，幾乎不表達(dá)，表明的表達(dá)具有組織特異性。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.3 MdGA2ox8表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草植株的鑒定

用Ⅰ和HⅠ酶將從克隆載體上切下，與相同酶切的pCAMBIA1301-35SN載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，經(jīng)PCR鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-35SN-（圖1-A）。提取質(zhì)粒并成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。用陽性單菌落農(nóng)桿菌菌液（OD=0.5）侵染煙草葉片，共培養(yǎng)3 d，用無菌水洗滌3次，無菌濾紙吸干水分，接種在10 mg·L-1的Hyg抗性培養(yǎng)基中，篩選培養(yǎng)30 d，獲得22個(gè)抗潮霉素的煙草抗性芽，GUS檢測(cè)結(jié)果表明，其中7株為GUS陽性植株（圖5-A），近一步提取這7株煙草DNA，用-F1和-R1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以野生型煙草葉片為對(duì)照，結(jié)果顯示，在獲得的7株GUS陽性植株中，6株成功檢測(cè)到（圖5-B），推斷已成功導(dǎo)入煙草基因組中。為了進(jìn)一步驗(yàn)證在轉(zhuǎn)基因陽性植株中是否在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，提取經(jīng)PCR檢測(cè)的陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測(cè)的表達(dá)。結(jié)果表明，有5個(gè)抗性植株中擴(kuò)增得到片段大小一致的特異條帶（圖5-C）；膠回收、克隆測(cè)序表明，所擴(kuò)增條帶為目的基因序列，進(jìn)一步證明成功導(dǎo)入煙草基因組中并在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行表達(dá)，得到5個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因植株。

M：Marker；1—7（B）、2—7（C）：轉(zhuǎn)基因煙草植株transgenic tobacco plants；8：pCAMBIA1301-35SN-MdGA2ox8質(zhì)粒pCAMBIA1301-35SN-MdGA2ox8 vector；WT（A）、9（B）、1（C）：野生型煙草Wild-type tobacco

2.4 MdGA2ox8過表達(dá)對(duì)煙草形態(tài)指標(biāo)的影響

經(jīng)過生根、煉苗、移栽，3個(gè)月后，過表達(dá)影響了轉(zhuǎn)基因煙草的株高、節(jié)間長(zhǎng)度和開花時(shí)間。如圖6-A、6-B所示，轉(zhuǎn)基因株系L-1、L-6、L-7、L-11和L-31出現(xiàn)明顯的花期延遲和矮化表型，分別比野生型低66%、81%、94%、75%和88%，其中野生型株高達(dá)到38.5 cm，而轉(zhuǎn)基因株系L-7和L-31株高分別只有2.3和4.5 cm。同時(shí)與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草的節(jié)間長(zhǎng)度均有所縮短，以L-7和L-31株系節(jié)間縮短最為嚴(yán)重（圖6-C）。此外，轉(zhuǎn)基因煙草葉片長(zhǎng)寬比均比野生型顯著降低（圖6-D）。野生型煙草開花時(shí)間為85—90 d，而轉(zhuǎn)基因株系均未開花。

2.5 MdGA2ox8過表達(dá)對(duì)煙草葉綠素含量的影響

轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量均高于野生型，其中L-1、L-7、L-11、L-31株系的葉綠素含量與野生型相比達(dá)顯著水平，分別比野生型提高61%、44%、31%和27%，而L-6株系的葉綠素含量?jī)H比野生型高13%（圖7）。

2.6 MdGA2ox8過表達(dá)對(duì)煙草GA1、GA4含量的影響

為研究過表達(dá)對(duì)赤霉素合成的影響及主要作用通路，選取野生型煙草和轉(zhuǎn)表達(dá)量高的煙草植株葉片，測(cè)定GA1和GA4的含量。從圖8-A可以看出，轉(zhuǎn)的煙草植株葉片中GA1含量均高于野生型，其中，野生型的GA1含量為1.26 ng·g-1，L-6、L-7和L-31株系GA1的含量分別為野生型的1.32、1.29和1.56倍。然而，轉(zhuǎn)基因植株的GA4含量均低于野生型（圖8-B）。如圖8-C所示，過表達(dá)的煙草中GA1+GA4總含量均低于野生型，其中野生型的GA1+GA4總含量為6.69 ng·g-1，株系L-6、L-7和L-31的GA1+GA4總含量分別為3.08、1.90和3.47 ng·g-1。

WT：野生型煙草wild-type tobacco；L：轉(zhuǎn)基因株系transgenic line；L-1、L-6、L-7、L-11、L-31：MdGA2ox8過表達(dá)煙草的5個(gè)株系MdGA2ox8overexpression tobacco

圖7 MdGA2ox8過表達(dá)對(duì)煙草葉綠素含量的影響

2.7 赤霉素相關(guān)基因在煙草中的表達(dá)

為確認(rèn)轉(zhuǎn)基因煙草株高的降低（圖6-A、6-B）是由的過表達(dá)所致，以煙草葉片的cDNA為模板，利用RT-qPCR技術(shù)分析了轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量。結(jié)果表明，野生型煙草中無的表達(dá)，而轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達(dá)量極高，且各轉(zhuǎn)基因株系間其表達(dá)量不同（圖9-A）。此外，轉(zhuǎn)基因煙草L-6、L-7、L-11、L-31株系中和的表達(dá)量均高于野生型，而L-1株系中其表達(dá)量低于野生型（圖9-B、9-C）。

圖8 MdGA2ox8過表達(dá)對(duì)煙草葉片赤霉素含量的影響

圖9 RT-qPCR檢測(cè)MdGA2ox8過表達(dá)株系

3 討論

赤霉素是一個(gè)較大的萜類化合物家族，在植物整個(gè)生命循環(huán)過程中起著重要的調(diào)控作用。植物中是一個(gè)小基因家族，由多個(gè)基因編碼，目前已從擬南芥中分離得到8個(gè)[26-27]，但在蘋果上相關(guān)基因的克隆與分析卻沒有很好地開展[17-18]。本研究成功獲得了蘋果ORF，其具有基因家族共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，含有DIOX-N和20G-Fell_Oxy保守結(jié)構(gòu)域，通過同源分析結(jié)果顯示與其他物種的基因同源性最高達(dá)90%，因此推測(cè)該基因?qū)儆诨蚣易宓某蓡T，命名為。本研究將MdGA2ox8與其他10種植物的15條GA2ox序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[13]，與AtGA2ox8和AtGA2ox7聚為一類，可能主要催化C20-Gas（GA12和GA53）2-羥基化[15]。

本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法獲得了5株轉(zhuǎn)基因株系，結(jié)果表明過表達(dá)煙草引起植株的矮化、節(jié)間縮短，葉片長(zhǎng)寬比降低和花期延遲。Schomburg等[28]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)導(dǎo)致煙草矮化和花期推遲。此外，Kotoda等[5]也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)擬南芥出現(xiàn)矮化和晚花表型；過表達(dá)和煙草節(jié)間嚴(yán)重縮短，植株矮化[28]，這與本研究結(jié)果相一致。另外，轉(zhuǎn)基因煙草株系的總?cè)~綠素含量均高于對(duì)照，說明過表達(dá)不僅誘導(dǎo)植株矮化，還提高了總?cè)~綠素含量，這與王慶杰等[29-31]研究結(jié)果一致。

赤霉素合成代謝早期途徑在高等植物中基本相同，而在GA12以后的代謝途徑中，在不同物種和不同組織中的表達(dá)量有較大差異。在荔波連蕊茶中在嫩枝和兩年生莖段中的表達(dá)量最高[15]；在蜜柑成年樹的新葉和花芽以及幼苗莖中表達(dá)，但在其他組織中表達(dá)量較低[5]。本研究的結(jié)果與上述結(jié)果不同，主要在花中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在幼果和木質(zhì)部中幾乎不表達(dá)，這可能是物種或時(shí)間不同所致。因此推測(cè)主要在花中起作用，以控制活性GA的水平，可能參與果實(shí)的形成，但不參與果實(shí)和木質(zhì)部的發(fā)育。

RT-qPCR技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中常用的檢測(cè)基因表達(dá)水平的技術(shù)手段[10]，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草株系基因表達(dá)水平進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量顯著高于野生型，說明這5株轉(zhuǎn)基因煙草均為過表達(dá)株系，但各株系間表達(dá)量具有差異，這與李軍等[32]的研究結(jié)果相一致，推測(cè)其表達(dá)量的差異可能是插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)的不同造成的[33]。此外，赤霉素合成相關(guān)基因和在株系L-6、L-7、L-11和L-31中的表達(dá)量均高于野生型，筆者推測(cè)可能是由于過表達(dá)，導(dǎo)致具有生物活性的GA含量降低，從而提高了和的表達(dá)量。而轉(zhuǎn)基因株系L-1的和表達(dá)量較低，推測(cè)可能是表達(dá)量未達(dá)到反饋調(diào)節(jié)水平。

在植物體內(nèi)，具有生物活性的GA有GA1、GA3、GA4和GA7[2]。GA2ox作用于有生物活性的GA1和GA4，分別將它們轉(zhuǎn)變成無活性的分解代謝物GA8和GA34，使植物體內(nèi)GA的活性降低[3]。為檢測(cè)過表達(dá)對(duì)赤霉素合成與代謝的影響，進(jìn)而研究的作用通路，選取轉(zhuǎn)表達(dá)量高的煙草植株（L6、L7、L31）和野生型煙草植株的葉片，測(cè)定赤霉素GA1和GA4的含量。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片中GA1與GA4含量的總和比野生型低，這可能是引起煙草植株節(jié)間縮短、矮化的主要原因，這與擬南芥中過表達(dá)導(dǎo)致赤霉素含量的減少進(jìn)而植株矮化的研究結(jié)果一致[5]，也有研究表明，在煙草中過表達(dá)降低了煙草活性GA的水平并引起矮化[28]。劉露露等[31]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)煙草GA4含量增加而GA1含量并無顯著變化；Xiao等[34]分析內(nèi)源GA顯示轉(zhuǎn)（）植物中GA4和GA1水平降低，與野生植物相比GA34含量增加。本研究與其結(jié)果一致，在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中GA4含量顯著低于野生型，但與其研究結(jié)果不同的是GA1含量較高于野生型。結(jié)合煙草赤霉素合成相關(guān)基因分析，推測(cè)GA1含量相比野生型增加，可能是由于赤霉素合成相關(guān)基因（如）表達(dá)量上升的原因。然而，本研究結(jié)果表明GA4含量的降低是活性GA含量降低的主要因素，因此推測(cè)主要作用于分解代謝活性GA4轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的GA34，從而影響植株高度。

4 結(jié)論

從‘蘇帥’蘋果中克隆得到長(zhǎng)為1 122 bp的開放閱讀框（ORF），編碼373個(gè)氨基酸，屬于PcbC superfamily超家族，有DIOX_N和2OG-FeII_Oxy保守結(jié)構(gòu)域，同源序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析均表明其與白梨同源性最高，進(jìn)化關(guān)系最近。過表達(dá)降低了煙草葉片中GA4含量，導(dǎo)致煙草節(jié)間縮短、植株矮化、葉色深綠、葉片長(zhǎng)寬比降低以及延遲開花時(shí)期；正反饋調(diào)節(jié)赤霉素合成相關(guān)基因和的表達(dá)量。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Cloning and Function Analysis of Apple Gibberellin Oxidase Gene

LI FeiHong, Hou YingJun, LI XueHan, YU XinYi, QU ShenChun

(College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)

【Objective】The objective of this study is to clone the open reading frame (ORF) of a gibberellin 2-oxidase gene (gibberellin2-oxidase 8,) from apple cultivar ‘Sushuai’, to analyze its sequence characteristics and tissue expression specificity. The effects of overexpression ofon tobacco growth and development were studied in order to provide a theoretical reference for the functional analysis and application of the gene.【Method】The ORF region ofwas cloned from apple by RT-PCR method. The amino acid sequence alignment and conserved domain analysis were performed by NCBI, DNAMAN and Pfamonline software. The composition, theoretical molecular weight and isoelectric point (pI) of the amino acid were deduced by Expasy software online. The protein signal peptide and transmembrane domain were analyzed by SignalP and TMHMM Server V.2.0. The phylogenetictree was constructed by a neighbor-joining (NJ) method using MEGA 7.0 program. The expression level in different tissues of apple was detected by RT-qPCR. To characterize the function of,ORF driven by thepromoter was delivered into tobacco by-mediated transformation approach. Transgenic plants with hygromycin resistance were obtained and identified by using GUS staining, genomic PCR, and RT-PCR. After transplanting, the plant height, internode length, blade aspect ratio, content of chlorophyll, and content of GA1, GA4in tobacco were measured at the first flowering stage. The expression level of related genes in tobacco was analyzed by RT-qPCR.【Result】The ORF sequence ofobtained from ‘Sushuai’ is 1 122 bp in length, encoding a putative protein about 373 amino acids. The predicted molecular weight of MdGA2ox8 is 42.8 kD, the theoretical pI is 5.44 and the instability coefficient is 49.73. MdGA2ox8 contains conserved domains DIOX_N and 20G-Fell_Oxy, without obvious hydrophobic region, transmembrane domain and signal peptide. The MdGA2ox8 protein is a non-secreted protein. Phylogenetic analysis showed that theMdGA2ox8 protein was closely related toGA2ox8 protein. The RT-qPCR results showed thatwas differentially expressed in apple tissues, with the highest expression in flowers, followed by old leaf＞young leaf＞phloem, but almost no expression in xylem and fruitlet. Five transgenic positive lines were obtained by transferringinto model plant tobacco. Compared with the wild-type, the GA4content decreased and GA1content increased in overexpressedtobacco plants. the average content of GA1in wild-type and transgenic tobacco was 1.26 and 1.75 ng·g-1, respectively. The average content of GA4in wild-type and transgenic tobacco was 5.43 and 1.07 ng·g-1, respectively. Compared with the wild-type, the total content of GA4and GA1in transgenic tobacco plants decreased, resulting in shorter internode length, dwarfing and delayed flowering. The average height of wild-type and transgenic tobacco plants was 38.50 and 7.36 cm, respectively. The average internode length of tobacco plants was 9.5 and 3.3 cm, respectively. The leaf of transgenic tobacco was dark green and the leaf aspect was reduced. Moreover, the expression level of endogenous gibberellin synthesis pathway-related genesandwas positively regulated by【Conclusion】The ORF of gibberellin 2-oxidase genewas obtained. The difference of tissue expression inwas found. The total content of GA1and GA4inoverexpressed tobacco decreased, which resulted in the shortening of internode length and dwarfing of plants.

apple (); gibberellin oxidase; dwarf;; overexpression; tobacco

2018-06-04；

2018-07-16

國家自然科學(xué)基金（3187110456）、江蘇省科學(xué)技術(shù)廳現(xiàn)代農(nóng)業(yè)-重點(diǎn)及面上項(xiàng)目（BE2017367）

李飛鴻，E-mail：798247396@qq.com。

渠慎春，Tel：025-84395724；E-mail：qscnj@njau.edu.cn