王 平， 常 娟， 劉超齊， 尹清強*， 黃瑋瑋， 王 濤， 黨曉偉， 盧富山

（1.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州 450002；2.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng) 453000；3.河南普愛飼料股份有限公司，河南周口466000）

秸稈木質纖維素作為結構性碳水化合物是自然界存在的數(shù)量巨大的可再生資源，富含豐富的纖維素和半纖維素（Ravindran等，2016）。然而，因缺乏有效的處理方法，大部分秸稈資源都作為廢棄物被焚燒或埋置于農田。秸稈中的纖維素和半纖維素可以通過微生物發(fā)酵和酶解轉化成葡萄糖單體、乙醇、糠醛、動物飼料、能量和其他化學原料（Zu等，2014；Gregg等 1996）。 但是木質素復雜的高分子網狀芳香類聚合物可阻礙纖維素酶接近纖維素聚合物，因此，怎樣去分解木質素以提高纖維素聚合物糖化效率至關重要。

目前，“人畜爭糧”矛盾日益激烈，特別是在世界人口迅速增長的今天，如何解決這個矛盾變得越來越重要。將秸稈中結構性碳水化合物轉變成葡萄糖替代動物飼料中的能量原料是可行的。Guo 等（2013）和 Chang 等（2012）報道，玉米秸稈通過物理處理和微生物發(fā)酵可以轉變成動物飼料，這將有助于解決畜牧生產中飼料短缺問題。

關于木質素裂解和提高秸稈實用性的方法很多，比如酸、堿、蒸汽爆破和有機溶劑處理已經用于秸稈以提高酶解效率 （寇巍等，2010；王堃等，2006；Saha等，2005；張利等 2001；Yoon 等，1995）。通常高濃度化學處理（強酸、強堿）效果優(yōu)于低濃化學處理（弱酸、弱堿）（Han 等，2012）。 但是秸稈作為動物飼料開發(fā)，高濃度化學處理不僅會損害動物的健康，還因需要大量的水沖洗處理產物，造成環(huán)境污染和成本增加。研究表明，酸和堿處理秸稈生產乙醇取得顯著成就，但是因化學離子（Na+，Ca2+和Cl-）超出動物營養(yǎng)標準不適用于飼料生產。二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺和1,3-二甲基-2-咪唑烷酮等有機溶劑作為共溶劑來處理秸稈（Mai等，2014），但是這些處理造成有毒有害化學物質加入對動物健康有害。

為了避免上述處理方法中存在的弊端，本研究根據(jù)各種木質纖維素原料預處理方法和NRC（1994）動物營養(yǎng)標準及單胃動物生長特性，選擇氧化鈣、氫氧化鈉、雙氧水及氨水作為化學試劑。因為Ca2+和Na+是動物必需的礦物元素，動物營養(yǎng)標準中關于家禽對Ca2+和Na+需求分別為0.8%～2.0%和0.12～0.2%，所以選擇低濃度石灰、2%（m/m）氫氧化鈉來處理玉米秸稈?；瘜W處理秸稈中殘留的Ca2+和Na+可以被動物吸收，以減少飼糧配方中石粉和食鹽的添加。 雙氧水作為強氧化劑，遇熱分解成水和氧氣，作為秸稈飼料處理具有綠色和無殘留特點。雙氧水濃度的選擇，從安全的角度考慮，選擇低濃度作為本研究的添加量。氨水作為弱堿性試劑，其殘留的少量氮對動物無毒無害，可以被腸道微生物利用。

根據(jù)木質纖維素各組分特點，選擇易于生產的低溫熱處理方法來降解木質纖維素。因為高溫處理（＞100°C）生產成本高，對設備要求嚴格，而且部分纖維素和半纖維素分解成還原糖，會進一步轉化成糠醛、甲酸和丙酸等副產物，不僅影響動物健康，還對酶解產生抑制作用，所以本研究選擇處理溫度 ＜100°C。

本試驗在低溫、低濃度下，研究石灰+氫氧化鈉、氨水和雙氧水單獨處理及復合化學低溫處理方法對玉米秸稈降解的影響，通過對不同預處理玉米秸稈中木質纖維素含量及酶解后還原糖的測定，篩選出最佳的處理組合，為玉米秸稈飼料化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 玉米秸稈取自河南省原陽縣郊區(qū)，挑選干凈秸稈去根，自然風干。經錘片式粉碎機粉碎，過篩1 mm，室溫保存。 纖維素酶和木聚糖酶市購。根據(jù)美國可再生能源實驗室（NREL）纖維素酶測定方法（IUPAC，1987）測定纖維素酶活和木聚糖酶活。纖維素酶中包括纖維素酶（323 FPU/g）和木聚糖酶（500 U/g），其蛋白質含量為142 mg/g；木聚糖酶中的酶活力為5000 U/g，其蛋白質含量為6 mg/g；酶蛋白含量的測定采用Bradford（1976）方法。

1.2 試驗設計

1.2.1 化學-熱解秸稈 采用四因素四水平正交試驗設計，分別以 2%（m/m）NaOH+CaO濃度（6%、9%、12%、15%）、 處 理 溫 度 （60、70、80、90℃）、處理時間（3、6、9、12 h）、液固比（7∶1、9∶1、11∶1、13∶1）；氨水濃度（0%、5%、10%、15%）、處理溫度（20、40、60、80 ℃）、處理時間（6、12、18、24 h）、液固比 （7∶1、9∶1、11∶1、13∶1）； 雙氧水濃度 （2%、3%、4%、5%）、處理溫度（50、60、70、80 ℃）、處理時間（2、4、6、8 h）、液固比（7∶1、9∶1、11∶1、13∶1）進行化學熱處理，每個處理3個重復，正交試驗設計分別見表 1、2、3。

不同石灰濃度是取上清液，制備如下：每組處理風干秸稈樣品重15.0 g，按照秸稈重的百分數(shù)計，取6% ～15%石灰（m/m），溶于按照不同液固比（水∶秸稈）所取的水中，攪拌5 min，靜止10 min，取上清液。

表1 CaO+2%NaOH正交試驗因素

表2 氨水正交試驗因素

表3 雙氧水正交試驗因素

1.2.2 單一和復合化學處理秸稈 本試驗是在正交試驗最佳處理條件基礎上進行。試驗設計分組如下：

1組：未處理秸稈；2組：氨水；3組：2%NaOH+CaO；4組：雙氧水；5組：氨水+雙氧水；6組：2%NaOH+CaO+雙氧水；7組：氨水+2%NaOH+CaO+雙氧水；8 組：2%NaOH+CaO+氨水+雙氧水；9組：氨水+雙氧水+2%NaOH+CaO；10組 ：2%NaOH+CaO+雙 氧水+氨 水 ；11 組 ：2%NaOH+CaO+雙氧水+氨水+雙氧水；12組：2%NaOH+CaO+氨水 （同時加入）+雙氧水；13組：2%NaOH+CaO+氨水+雙氧水 （同時加入）；14組：2%NaOH+CaO+氨水。復合處理中液固比均以第一個處理試劑液固比為準。

1.2.3 纖維素酶和木聚糖酶酶解預處理秸稈 酶解處理是以5%（m/V）秸稈加到蒸餾水中，酶負荷量為纖維素酶32.3 FPU/g秸稈（相當于14.2 mg蛋白質/g秸稈）和木聚糖酶550 U/g秸稈（相當于0.6 mg蛋白質/g秸稈），用0.05 mol/L HCL或Ca（OH）2上清液調整pH至4.8， 在50°C和180 r/min的搖床中酶解48 h，酶解結束后100°C處理30 min使酶解反應終止，酶解產物50°C烘干，粉碎。

1.2.4 指標測定方法

1.2.4.1 還原糖測定 取處理后秸稈5.0000 g，加入50 mL蒸餾水，浸泡24 h，濾紙過濾，取濾液測還原糖，采用 DNS 法（Miller，1959）。

1.2.4.2 木質纖維素的測定 采用濾袋法。中性洗滌纖維（NDF）采用國標GB/T20806-2006；酸性洗滌纖維（ADF）采用Van Soest測定法；酸性洗滌木質素（ADL）采用國標GB/T20805-2006。計算方法：

式中：Y表示相對于處理前秸稈中各指標的含量；X表示處理秸稈中各指標的含量；W1表示處理后秸稈干物質重量；W2表示處理前秸稈干物質重量；

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS 20統(tǒng)計分析軟件對各數(shù)據(jù)進行方差分析和Duncan’s多重比較，差異顯著用p＜0.05表示，所有結果均以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 氧化鈣+2%氫氧化鈉處理對秸稈酶解效果的影響 氧化鈣+2%氫氧化鈉正交試驗結果及方差分析分別見表4和表5。由表4可知，RA＞RB＞RC＞RD，說明處理溫度對玉米秸稈酶解作用影響最大，其次為處理時間，再次為氧化鈣濃度，而液固比的影響較小。由表5可知各因素對還原糖的提高無顯著影響。因此，根據(jù)正交表得出最佳處理條件為 A3B2C2D3，即處理溫度 80 °C，時間 6 h，氧化鈣濃度 9%，液固比 11∶1。

表4 氧化鈣+2%氫氧化鈉正交試驗結果

表5 氧化鈣+2%氫氧化鈉正交試驗結果的方差分析

2.2 氨水處理對秸稈酶解效果的影響 氨水正交試驗結果及方差分析分別見表6和表7。由表6可知，RC＞RA＞RD＞RB，說明氨水濃度對玉米秸稈酶解作用影響最大，其次處理溫度，再次液固比，而處理時間的影響較小。由方差分析表7可知，氨水濃度對還原糖得率有顯著影響，其他各因素影響不顯著。因此，根據(jù)正交表得出最佳處理條件為A4B2C4D2，即處理溫度 80 °C，時間 12 h，氨水濃度15%，液固比 9∶1。

表6 氨水正交試驗結果

表7 氨水正交試驗結果的方差分析

2.3 雙氧水處理對秸稈酶解效果的影響 雙氧水正交試驗結果及方差分析分別見表8和表9。由表8 可知，RC＞RD＞RB＞RA，說明雙氧水濃度對玉米秸稈酶解作用影響最大，其次液固比，再次處理時間，而處理溫度的影響較小。由方差分析表9可知，各因素對還原糖得率無顯著影響。因此，根據(jù)正交表得出最佳處理條件為A1B2C3D4，即處理溫度50°C，時間 4 h，雙氧水濃度 4%，液固比13∶1。

表8 雙氧水正交試驗結果

表9 雙氧水正交試驗結果的方差分析

2.4 單一和復合化學處理對秸稈中木質纖維素含量的影響 根據(jù)上述正交試驗結果得出各單一化學處理最佳條件為：9% 氧化鈣 （上清液）+2%氫氧化鈉以液固比11∶1，80°C處理 6 h；15% 氨水濃度以液固比 9∶1，80°C 處理 12 h；4%雙氧水以液固比13∶1，50°C處理4 h。將單一和復合化學處理對比，結果見表10。由表10可知，未處理玉米秸稈中的纖維素含量為38.13%，半纖維素含量為30.52%，木質素含量為7.38%。與未處理組相比，除雙氧水處理組外，不同處理組玉米秸稈中纖維素含量相對增加了0.28%～7.7%，半纖維素含量均顯著降低（p＜0.05）；除氧化鈣+氫氧化鈉處理組，木質素含量顯著降低 （p＜0.05），其中2%NaOH+CaO+雙氧水+氨水+雙氧水組半纖維素和木質素降解率最高，分別為72.94%（p＜0.05）和79.95%（p＜0.05）。氨水和雙氧水處理均能顯著提高木質素降解率，且二者復合處理效果更好；而低濃度氧化鈣+氫氧化鈉處理對木質素降解效果不顯著，氧化鈣+氫氧化鈉與雙氧水復合效果顯著優(yōu)于單獨處理。

表10 不同處理對秸稈中木質纖維素含量及酶解后還原糖產量的影響

與未處理組相比，除雙氧水和2%NaOH+CaO+氨水+雙氧水（同時加入）組外，玉米秸稈酶解后所得還原糖均顯著增加（p＜0.05）。與酶解未處理秸稈相比，氨水+雙氧水及2%NaOH+CaO+雙氧水+氨水+雙氧水組酶解后還原糖含量提高6.02倍（p＜0.05）和 6.10倍（P ＜0.05）。與氨水組對比，2%NaOH+CaO+氨組酶解還原糖顯著降低（p＜0.05），這表明堿與氨水復合處理具有負效應，同時堿與雙氧水及氨水與雙氧水復合處理具有正效應。

3 討論

3.1 氧化鈣+2%氫氧化鈉處理對秸稈酶解效果的影響 氧化鈣是一種來源廣泛、價格低廉的原料，對處理過程中所產生的糠醛、乙酸等次生產物具有很好的解毒作用（Heredia-Olea等，2012；Cao等，2012）。氫氧化鈉作為強堿，在高濃度高溫的條件下，能夠有效地去除木質素，且提高酶解效率（李忠等，2013；陳廣銀等，2011）。 而秸稈作為飼料資源開發(fā)，對化學試劑的濃度范圍有嚴格的要求，兩種低濃度堿結合在秸稈預處理應用方面有著廣闊的前景 （Zhang等，2011）。本試驗結果顯示，在9%氧化鈣（上清液）+2%氫氧化鈉以液固比11∶1，80°C處理6 h條件下對玉米秸稈酶解效果較顯著，但是對木質素去除效果不顯著，其原因是低濃度堿只能對纖維素起到潤漲作用，以促進酶解。歐陽嘉等（2010）曾用20%（m/m）氫氧化鈉，80°C處理1 h，總糖得率較未處理秸稈提高46.66%，而本研究使酶解還原糖含量較未處理秸稈提高2.25倍。

3.2 氨水處理對秸稈酶解效果的影響 一般而言，將秸稈浸在10%（m/m）左右的氨水中處理24～48 h，可以脫除大部分木質素和對發(fā)酵不利的乙?；１狙芯拷Y果顯示，氨水處理在最佳條件下（15% 氨水、液固比 9∶1、80 °C 處理 12 h），對玉米秸稈酶解效果顯著。據(jù)報道，氨水處理可破壞玉米秸稈中木質素和多糖間的結合鍵，增加纖維素含量 （易守連，2010）。本研究結果表明，氨水濃度對玉米秸稈酶解作用影響最大，且隨著氨水濃度的增加預處理玉米秸稈酶解后還原糖含量顯著增加。李靜等（2011）用15%氨水，在40°C下處理39 h，還原糖得率為3.23%，而本研究使還原糖得率提高了4倍，取得了比較滿意的結果。

3.3 雙氧水處理對秸稈酶解效果的影響 雙氧水作為強氧化劑，遇熱分解成水和氧氣，作為秸稈飼料處理具有綠色和無殘留的優(yōu)點。本研究結果顯示，4%雙氧水、 液固比13∶1、50°C處理4 h對玉米秸稈酶解效果不顯著。郭佩玉等（1995）報道，雙氧水處理秸稈是不可行的；但是，通過電鏡觀察其對表皮纖維細胞的作用效果甚小。

3.4 單一和復合化學處理對秸稈中木質纖維素和酶解還原糖含量的影響 本試驗結果顯示，氨水單獨處理、低濃度堿與雙氧水、氨水與雙氧水復合處理均能提高木質素降解率和酶解的得糖率；堿與氨水復合處理效果小于單獨處理，且對添加次序有嚴格要求，說明氨水與堿復合處理有負效應，其原因為氨水遇堿促進了氨的分解。由于堿的潤漲，木質纖維素間的酯鍵發(fā)生皂化，而醚鍵發(fā)生分離，進而溶解出半纖維素，從而有利于酶和纖維素的接觸，提高纖維素的糖化效率，從而提高還原糖產量（林有勝等，2009）。徐忠等（2004）的研究表明，10%氨水處理大豆秸稈24 h，使纖維素含量提高70.27%，半纖維素降解41.45%，木質素降解30.16%。本研究利用15%氨水處理玉米秸稈12 h，秸稈中纖維素含量提高5.87%，半纖維素降解49.61%，木質素降解44.31%。2%NaOH+CaO+雙氧水+氨水+雙氧水復合處理玉米秸稈，木質素降解率最高可達79.95%，酶解后還原糖含量達484.61 mg/g干物質。

4 結論

通過單一和復合處理對比表明，堿與雙氧水復合處理效果顯著優(yōu)于單獨處理；氨水在低溫、低濃度條件下單獨處理秸稈能顯著提高酶解還原糖得率；低濃度氨水與雙氧水復合處理效果優(yōu)于2%NaOH+CaO與雙氧水復合處理；2%NaOH+CaO+雙氧水+氨水+雙氧水復合處理對木質素和半纖維素去除效果最佳。經過堿和雙氧水復合處理后，秸稈中還原糖含量提高，木質纖維素降低，為秸稈在單胃動物中的應用奠定了基礎。