王學(xué)東， 周建軍， 付國靜,， 胡駿鵬， 劉 瓊，胡先勤， 羅青平， 王海燕， 孫 敏

（1.武漢輕工大學(xué)，湖北武漢 430023；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；3.思科福（北京）生物科技有限公司，北京 100081；4.農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；5.北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司，北京 100081）

飼用酵母能促進(jìn)動(dòng)物新陳代謝，增強(qiáng)食欲，有利于動(dòng)物的消化吸收，加速動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育及生產(chǎn)性能的發(fā)揮，還能提高動(dòng)物的抗病、防病能力（Hatoum等，2012）。作為一株優(yōu)良的飼用酵母，其應(yīng)能夠耐受動(dòng)物消化道內(nèi)高酸性、高濃度膽酸鹽的惡劣環(huán)境，并具有產(chǎn)氣量小，發(fā)酵穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)（譚斌，2008）。本研究選取不同用途酵母菌株，對(duì)其環(huán)境抗逆性，即酸脅迫耐受性和膽酸鹽耐受性進(jìn)行研究，初步探討造成不同酵母菌株此種差異的環(huán)境抗逆性機(jī)理，并對(duì)其產(chǎn)氣能力進(jìn)行對(duì)比，研究不同用途酵母菌株產(chǎn)氣能力的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 無糖酵母 （無糖高活性干酵母）、耐高糖酵母（耐高糖高活性干酵母）、高酒酵母（福邦釀酒干酵母）、布拉迪酵母（可利貝健抗腹瀉專用干酵母）、畜禽酵母（畜禽專用干酵母）、反芻酵母（反芻專用干酵母）均由湖北宜昌安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基均為國產(chǎn)。

1.1.3 試劑 鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液、硝酸、氯化銫、乳酸、牛膽鹽等均為國產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌菌液的培養(yǎng) 取適量制備好的酵母菌懸液，用紫外分光光度計(jì)以無菌液體YPD為對(duì)照測(cè)其吸光度，調(diào)節(jié)菌液濃度OD600=0.8±0.02。

1.2.2 酵母菌酸脅迫耐受性

1.2.2.1 不同pH環(huán)境酵母菌生長(zhǎng)情況 在滅好菌的液體YPD培養(yǎng)基中加入適量乳酸 （85.0%～90.0%）調(diào)節(jié)其 pH 分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0（空白組），分別取1 mL調(diào)節(jié)好濃度的菌液接種于不同pH液體YPD培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，利用分光光度計(jì)法，每隔2 h測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm下的吸光值，至24 h，觀察酵母菌種在各pH下的生長(zhǎng)情況。

1.2.2.2 酵母培養(yǎng)液中Na+、K+濃度測(cè)定 取制備好的釀酒酵母發(fā)酵液5 mL，經(jīng)3000 r/min離心10 min，取上清液再用定量濾紙過濾后（約為4 mL），作為原樣品液低溫貯存。加熱消化，直至無色透明為止。加入適量水加熱去除多余的硝酸。待燒杯液體接近2～3 mL時(shí)，冷卻，用去離子水洗并轉(zhuǎn)移到10 mL刻度試管中，加水定容至刻度。取適量質(zhì)量濃度為1000 mg/L的Na+、K+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制標(biāo)準(zhǔn)系列使用液，濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL。 將消化樣液、試劑空白液、標(biāo)準(zhǔn)稀釋液分別導(dǎo)入火焰，測(cè)其發(fā)射強(qiáng)度。樣品中元素含量計(jì)算公式：

式中：x為試樣中元素的含量，mg/100 g；c為測(cè)定用試樣液中元素的濃度，μg/mL；c0為試劑空白液中元素的濃度，μg/mL；V為試樣液定容體積，mL；f為試樣液稀釋倍數(shù)；m為試樣的質(zhì)量，g。

1.2.3 酵母菌膽酸鹽耐受性

1.2.3.1 不同膽酸鹽濃度環(huán)境酵母菌生長(zhǎng)情況取適量制備好的菌懸液，在600 nm波長(zhǎng)處用液體YPD培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其OD值為0.8±0.02，在膽鹽濃度為 0%、0.30%、0.60%（牛膽鹽，Solarbio，中國）的液體YPD中培養(yǎng)24 h后，參考國標(biāo)GB4789.15-2010，計(jì)數(shù)cfu/mL計(jì)算其存活率，平行3組。計(jì)算公式為：

1.2.3.2 酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量測(cè)定 精確稱取鮮酵母0.1000 g（精確至0.0002 g）于離心管中，加入4.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液于振蕩器振蕩混勻后置于帶有冰塊的冰水中，每15 min振蕩一次，共1 h，于離心機(jī)3000 r/min離心5 min，將上清液倒入50 mL容量瓶中，用冰水洗滌離心管及沉淀，振蕩混勻后，再放入高速離心機(jī)中設(shè)定轉(zhuǎn)速和時(shí)間3000 r/min離心5 min，將上清液倒入50 mL容量瓶中，然后用冰水稀釋至刻度，搖勻。

式中：X為試樣中海藻糖的百分含量，%；E為試樣的吸光度；6.29為當(dāng)E=1時(shí)，每毫升溶液中含海藻糖的質(zhì)量，mg；W為試樣質(zhì)量，g；Ds為試樣干物質(zhì)的百分含量，%。

1.2.4 不同酵母菌株產(chǎn)氣特性 采用Risograph酵母活性測(cè)定儀測(cè)定不同酵母不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)氣量。稱取 （50±0.2）g樣品放入特定的量殼體里面，溫度30℃，時(shí)間12 h，酵母活性測(cè)量?jī)x內(nèi)置微處理器含有一個(gè)精準(zhǔn)的采樣時(shí)鐘和輸出緩沖器，保證測(cè)定結(jié)果的可靠性和精確度。RisoSmart軟件給出發(fā)酵能力電子數(shù)表和曲線，進(jìn)而分析和報(bào)告結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌種酸脅迫耐受性

2.1.1 不同pH環(huán)境培養(yǎng)酵母菌的生長(zhǎng)曲線 通過低pH沖擊試驗(yàn)，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定酵母在不同pH環(huán)境下的生長(zhǎng)情況，從圖1可以看出，6株不同酵母均可在低酸性環(huán)境中生長(zhǎng)，且在不同pH環(huán)境中的存活率隨pH下降而降低。其中，布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母3種酵母菌株在較低pH環(huán)境中的存活率均高于其余3種。由此可知，不同的pH環(huán)境對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)有非常顯著的影響，且不同酵母菌株對(duì)環(huán)境酸脅迫耐受性有顯著差異。

2.1.2 酵母培養(yǎng)液中Na+、K+濃度 從圖2可以看出，6種酵母培養(yǎng)液，Na+和K+的濃度均隨pH的降低而降低。有研究表明，Na+在生物膜上具有運(yùn)輸特性，即同向運(yùn)輸和反向運(yùn)輸同時(shí)進(jìn)行，其濃度變化在細(xì)胞內(nèi)呈動(dòng)態(tài)平衡（張國順等，2004；Isreal于50 mL容量瓶中加入4.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液，用冰水稀釋至刻度，搖勻，作為空白溶液。吸取空白及樣品1.00 mL于兩個(gè)潔凈干燥的試管中，再分別精確加入蒽酮試液5 mL，振蕩搖勻，沸水浴中反應(yīng)時(shí)間為10 min，拿出立即將樣液溫度冷卻至室溫，再次搖勻，放于分光光度計(jì)630 nm處，用1 cm比色皿測(cè)定吸光度，以空白作對(duì)照。試驗(yàn)樣品中海藻糖積累量的計(jì)算公式如下：等，1993），試驗(yàn)中，Na+濃度明顯降低可能是由于酵母細(xì)胞處于高酸性環(huán)境中時(shí)活菌數(shù)減少導(dǎo)致其從胞內(nèi)釋放到環(huán)境中的Na+減少。K+濃度的降低表明，酵母細(xì)胞在處于高酸性環(huán)境中時(shí)確實(shí)有大量K+進(jìn)入細(xì)胞，維持胞內(nèi)酸堿環(huán)境的穩(wěn)定，從而使得酵母細(xì)胞可以在高酸性的惡劣環(huán)境中存活。試驗(yàn)結(jié)果顯示，反芻酵母、布拉迪酵母和畜禽酵母3株試驗(yàn)用酵母菌株培養(yǎng)液中Na+濃度相對(duì)較高，而K+濃度相對(duì)較低，說明這3株酵母菌株的酸脅迫耐受性較其余幾株酸脅迫耐受性強(qiáng)，此結(jié)果與6株試驗(yàn)用酵母菌株的生長(zhǎng)曲線結(jié)果一致。

圖1 6種酵母菌株在不同pH環(huán)境中培養(yǎng)生長(zhǎng)情況

圖2 6種酵母在不同p H環(huán)境培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)液中金屬離子濃度變化

2.2 不同酵母菌株膽酸鹽耐受性

2.2.1 不同膽酸鹽濃度環(huán)境培養(yǎng)酵母菌的生長(zhǎng)曲線 通過膽酸鹽耐受性試驗(yàn)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定酵母菌在不同膽酸鹽濃度環(huán)境中的生長(zhǎng)情況。從圖3可以看出，6株不同酵母菌株均可在高濃度膽酸鹽環(huán)境中生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)相同的生長(zhǎng)趨勢(shì)。在未加入膽酸鹽的培養(yǎng)基中，6株酵母菌株均在培養(yǎng)6 h時(shí)出現(xiàn)快速增長(zhǎng)，到12 h后趨于平穩(wěn)，進(jìn)入穩(wěn)定期。在膽酸鹽濃度為0.3%的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)0～6 h時(shí)OD600呈下降趨勢(shì)，說明有大量菌體死亡；之后開始增加。在膽酸鹽濃度為0.6%的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到10 h時(shí)OD600才開始增加，說明隨著膽酸鹽濃度的增加，酵母菌體受到的損害越大。其中，布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母3種酵母菌株在較高膽酸鹽濃度環(huán)境中的存活率均高于其余3株，說明其膽酸鹽耐受性較其余酵母菌株更佳。

圖3 6種酵母菌株在不同膽酸鹽濃環(huán)境中培養(yǎng)生長(zhǎng)情況

2.2.2 酵母菌細(xì)胞胞內(nèi)海藻糖積累量 從圖4中可以看出，6種酵母胞內(nèi)海藻糖積累量隨膽酸鹽濃度的增加而降低，這可能是由于酵母細(xì)胞處于高濃度膽酸鹽環(huán)境中時(shí)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損害，部分細(xì)胞死亡所致。6株供試酵母菌胞內(nèi)海藻糖含量由高到低排列的順序?yàn)椋悍雌c酵母、布拉迪酵母、畜禽酵母、高酒酵母、耐高糖酵母、無糖酵母，此結(jié)果與其生長(zhǎng)曲線結(jié)果一致，說明反芻酵母、布拉迪酵母、畜禽酵母較其余用途酵母菌株膽酸鹽耐受性更佳。

2.3 不同酵母菌株的產(chǎn)氣特性 作為一株優(yōu)良的飼用酵母菌株，尤其是反芻動(dòng)物專用飼用酵母菌株，其應(yīng)具備產(chǎn)氣量小、發(fā)酵穩(wěn)定的特點(diǎn)（Hofmann等，2008）。從圖5中可以看出，6株不同酵母菌株均可持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)酵，并產(chǎn)生一定量的氣體。其中，無糖酵母和高糖酵母兩種酵母產(chǎn)氣量最高，畜禽酵母和布拉迪酵母次之，反芻酵母和高酒酵母最低。

圖4 6種酵母在不同膽酸鹽濃度培養(yǎng)24 h后胞內(nèi)海藻糖積累量

圖5 6株不同用途酵母菌株總產(chǎn)氣情況

3 討論

不同用途的酵母菌株需具備不同的特性，作為一株優(yōu)良的飼用酵母菌株，其必須可耐受動(dòng)物消化道內(nèi)的低pH和高濃度膽酸鹽環(huán)境，在通過動(dòng)物的胃部到達(dá)消化道內(nèi)時(shí)具有良好的活性（Didari等，2014）。本試驗(yàn)通過對(duì)供試的6種不同用途的酵母菌株進(jìn)行環(huán)境抗逆性比較，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行初步探究。6株酵母菌株均可在較低pH環(huán)境和較高濃度的膽酸鹽環(huán)境中生長(zhǎng)，但不同用途酵母菌株對(duì)環(huán)境酸脅迫耐受性及膽酸鹽耐受性表現(xiàn)出顯著差異，供試6株酵母菌株中，作為飼用酵母菌株使用的3株酵母菌株，即布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母表現(xiàn)出較強(qiáng)的酸脅迫耐受性和膽酸鹽耐受性。且其細(xì)胞內(nèi)金屬離子Na+和K+濃度及胞內(nèi)海藻糖積累量均與其相對(duì)應(yīng)的環(huán)境耐受性表現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)，說明當(dāng)酵母細(xì)胞處于較為惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境中時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)的一些物質(zhì)會(huì)做出相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)保護(hù)其細(xì)胞免受損害而存活。

不同用途的酵母菌株的產(chǎn)氣能力存在差異，發(fā)酵面食專用酵母菌株如高糖酵母，應(yīng)具有較好的產(chǎn)氣能力（蘇東海，2008），而飼用酵母若產(chǎn)氣能力好產(chǎn)氣量大，在動(dòng)物進(jìn)食后其進(jìn)入動(dòng)物消化道內(nèi)會(huì)引起動(dòng)物腹脹，如可能會(huì)引起反芻動(dòng)物的瘤胃膨氣（王山宏等，2006），因此，飼用酵母應(yīng)具備產(chǎn)氣量小的特點(diǎn)，尤其是反芻動(dòng)物專用飼用酵母菌株。本試驗(yàn)分析了6種不同用途的酵母菌株的產(chǎn)氣特性。其中，反芻酵母產(chǎn)氣能力最差，無糖酵母與高糖酵母產(chǎn)氣能力相對(duì)較好。

4 結(jié)論

不同用途的酵母菌株的環(huán)境耐受性及產(chǎn)氣能力存在差異，不同菌株的酸脅迫耐受性與其細(xì)胞內(nèi)Na+、K+濃度變化有密切關(guān)系，膽酸鹽耐受性與其胞內(nèi)海藻糖積累量密切相關(guān)。研究試驗(yàn)菌株中布拉迪酵母、反芻酵母和畜禽酵母3株酵母菌株的酸脅迫耐受性和膽酸鹽耐受性較其余3株酵母菌株強(qiáng)，且6株供試酵母菌中，反芻酵母、畜禽酵母和布拉迪酵母的產(chǎn)氣能力均在中等產(chǎn)氣能力以下，故此3種酵母菌株適合作為飼用酵母益生菌株使用。