周楊 張亦默 王嘉偉 林莉 劉冬云 孟慶瑞

(河北農業(yè)大學，保定，071000)

美女櫻與細葉美女櫻是優(yōu)良的草本花卉，原產于熱帶至溫帶美洲，近年來，以其優(yōu)良的觀賞特性和廣泛的適應性在我國園林應用中嶄露頭角，開始應用在觀花草坪、花壇、花境、盆花和地被栽植中，逐漸被人們認識、接受和喜愛[1-2]。但當前的研究除主要局限在栽植養(yǎng)護[3-4]層面外，僅有少量組織培養(yǎng)[5]、雜交種間親和研究等[6-9]，不足以為種質創(chuàng)新和遺傳改良創(chuàng)造基礎。核型分析主要通過研究其染色體數及染色體形態(tài)特征來反映不同物種或品種之間存在的染色體細胞學差異，是從細胞層面研究種間遺傳變異、系統(tǒng)演化以及親緣關系。

本研究首次對美女櫻與細葉美女櫻進行了細胞學研究，以國內外常用的10個美女櫻與細葉美女櫻種(品種)為試驗材料，根據其染色體數目及形態(tài)特征進行分析,并探究其進化趨勢，旨在為后續(xù)的雜交育種、基因定位等提供必要的細胞學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為10個美女櫻與細葉美女櫻種(品種)培根的根尖，名稱詳見表1。

表1 試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 染色體制片方法

使用胚根作為試驗材料。將種子消毒后置于光照培養(yǎng)箱中15～20 ℃培養(yǎng)，待其胚根長為0.5～1.5 cm時，于09:00—10:00取出并置于冰水混合物中24 h進行預處理。然后將胚根置于固定液(V(冰乙酸)∶V(無水乙醇)=1∶3)中，在冰箱中4 ℃固定24 h(或放置于70%的酒精中，置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆?；然后將胚根放入1 mol·L-1鹽酸解離液中，在60 ℃恒溫水浴中解離。解離時間設為6、8、10、12 min四個時段。取胚根根尖尖端1～2 mm白色球狀分生組織，滴加改良石炭酸品紅溶液，染色8～12 min；染色完成后蓋上蓋玻片，垂直壓片，將其輕輕敲打至材料呈霧狀；而后將壓片置于萊卡顯微鏡下，在10×100倍油鏡下滴油觀察，各試驗材料各選取30個左右染色體分散良好的細胞進行染色體計數，以確定染色體數目，并用計算機進行顯微攝影。

1.2.2 數據分析

從鏡檢照片中選取5個染色清晰、分散較好、著絲點較為明顯的細胞進行染色體核型分析。用萊卡顯微鏡軟件和ImageJ軟件測量各個細胞中染色體長臂和短臂的絕對長度，參照喬永剛等[10]所述方法利用EXCEL軟件制作核型模式圖，按照李懋學等[11]提出的標準進行分類分析，用Levan提出的公式計算相對長度[12]，用Stebbins[13]提出的方法將染色體核型按對稱性程度的不同分為12種類型(1A～4C)，1A為最對稱核型,4C為最不對稱核型，參照Arano[14]提出的方法計算核型不對稱系數(As，K)，并用Photoshop和Excel軟件進行輔助分析。具體核型分析標準如下：

染色體長度比=最長染色體長度/最短染色體長度；

臂比值=長臂長度/短臂長度(精確到0.01)；

根據臂比值將染色體按表2進行分類，以確定著絲點的位置；

按表3核型分類標準進行核型分類；

核型不對稱系數(As，K)=(長臂總長度/全組染色體總長度)×100%。

2 結果與分析

2.1 染色體核型特征

各種(品種)均為二倍體種，染色體基數為x=5(表4)，根尖細胞中的染色體數目均為2n=2x=10。染色體鏡檢照片見圖1，染色體核型模式圖見圖2，主要核型參數見表4，染色體核型圖見圖3。

圖1 10個美女櫻與細葉美女櫻種(品種)染色體照片

A.細葉美女櫻‘祥和’；B.細葉美女櫻‘夢幻曲’；C.美女櫻(藍)；D.美女櫻‘托斯卡納’(玫紅)；E.美女櫻‘托斯卡納’(藍)；F.美女櫻‘水晶’；G.美女櫻‘石英’(猩紅)；H.美女櫻‘石英’(紅)；I.美女櫻‘石英’(粉)；J.美女櫻‘魔力紫’。

圖2 10個美女櫻與細葉美女櫻種(品種)核型圖

表3 核型分類標準

注：N為臂比大于2的染色體所占百分比。

由表4可以看出，美女櫻、細葉美女櫻以兩種染色體為主(m，sm)，同時出現了st型染色體，基本由3種染色體(m，sm，st)組成?！ⅰ?紅)中出現了單個隨體，處在m染色體上。細葉美女櫻和美女櫻的染色體中m(中部著絲點區(qū))和sm(近中部著絲點區(qū))染色體所占的比例大。

由表4可知，美女櫻的核型分為1A、2A兩種，其中‘美女櫻’(藍)、‘托斯卡納’(玫紅)、‘托斯卡納’(藍)、‘水晶’、‘石英’(紅)為1A型，‘石英’(猩紅)、‘石英’(粉)、‘魔力紫’為2A型。細葉美女櫻均為2A型。最長臂與最短臂的比值，美女櫻為1.17～1.46、細葉美女櫻為1.21～1.52。臂比值大于2的染色體的比例，美女櫻占0～20%、細葉美女櫻占20%～40%。核型不對稱系數差別不大，為55.54%～62.33%。由如上信息可見，美女櫻和細葉美女櫻核型對稱性高，其中美女櫻的對稱性更為明顯，其中5個品種未出現臂比值大于2的染色體，細葉美女櫻的對稱性普遍差于美女櫻。

縱坐標零點以上部分為短臂模式圖；縱坐標零點以下部分為長臂模式圖。

2.2 核型參數散點圖分析

核型越不對稱該物種越進化[13]。圖4以平均臂比和染色體長度比來衡量染色體的不對稱性，越在右上的品種越不對稱，其進化程度越高。供試材料中僅美女櫻(藍)和‘托斯卡納’(玫紅)在染色體長度比方向高于平均臂比方向，其余品種均是在平均臂比方向進化程度高。其中‘夢幻曲’在兩個方向進化程度均最高。

表4 10個美女櫻與細葉美女櫻種(品種)核型參數

圖4 供試材料核型不對稱程度散點圖(MAR-LR)

圖5以平均臂比和核型不對稱系數從另一個角度反映了核型的不對稱性，越靠近圖的右上角，越不對稱，則越進化，供試的10個品種均按平均臂比和核型不對稱系數向右上角方向進化，且與圖4相比，更為線性，在兩個方向的進化速度更為一致。其中‘夢幻曲’進化程度最大，最為進化，‘托斯卡納’(玫紅)、‘石英’(猩紅)、美女櫻(藍)則較原始。

圖5 供試材料核型不對稱程度散點圖(MAR-As.K)

3 結論與討論

植物有著明顯的生物節(jié)律性，不同時間植物有絲分裂的旺盛程度不同，選擇在有絲分裂高峰進行取材，所獲得的樣片中分裂相所占比例便較大，前人通過實踐研究，得出有絲分裂高峰普遍集中在08:00—12:00，不同物種間有所差異[15-16]，通過本試驗的觀察，美女櫻與細葉美女櫻的取材時間為08:30—09:30。

在解離過程中找到適合的解離時間對觀察效果至關重要，時間過短，會導致解離不充分，如果解離的時間過長，會使解離過度[17]，進而影響觀察效果，所以解離時間是能否找到清晰細胞分裂相的一個重要因素。本試驗比較了1 mol·L-1HCl解離液在不同時間梯度下的解離效果，解離時間過短，不能充分軟化細胞壁中的纖維素和果膠，細胞不易壓散，鏡下呈現出細胞難以分散，重疊聚集，難以觀察，所以得不到清晰的細胞分裂相；當解離時間過長時，細胞過于散碎，染色體太分散，染色較淺，且呈現出細胞膜消失，染色體四散，不易觀察[18]。

不同試驗材料的解離結果也有著明顯差異，細葉美女櫻解離時間普遍較美女櫻短，即細葉美女櫻更易解離。解離6 min時，細葉美女櫻細胞單層排列，染色體形態(tài)自然，易于染色，美女櫻細胞重疊聚集，無法觀察到清晰的染色體形態(tài)；解離8 min時，細葉美女櫻細胞分散，染色體形態(tài)自然，易染色，美女櫻細胞單層排列，染色體形態(tài)自然，易于染色；解離10 min時，細葉美女櫻細胞膜消失，染色體分散，美女櫻細胞分散，染色體形態(tài)自然，易染色；解離12 min時，細葉美女櫻細胞膜消失，染色體分散，染色淺，美女櫻細胞分散，細胞膜消失，部分染色體四散，因此，細葉美女櫻最佳解離時間為6 min，美女櫻為8 min，解離時間的不同可能是由于細胞壁結構、物質質量分數的差異。

美女櫻與細葉美女櫻各品種均為二倍體，染色體基數為x=5，染色體數目均穩(wěn)定為2n=2x=10，相似的核型說明它們在物種性和親緣關系存在一致性。此外，它們均以兩種染色體為主(m，sm)，有的品種同時出現了st型染色體。隨體出現在核型中的位置、數目不固定，所以隨體在細胞學鑒定中不是一種可靠的性狀，僅在雜種早期鑒定中可適當采用[19]，供試品種中‘石英’(紅)中出現了單個隨體，處在m染色體上，通常染色體帶有居間隨體會導致植物出現不育現象[20]，染色體類型的不同和隨體的有無也說明它們品種間的多樣性。

根據Stebbins對染色體核型按對稱性的研究，認為染色體的對稱性與進化程度呈反比。核型不對稱性的衡量可通過平均臂比和染色體長度比來表達[13]。本研究的美女櫻的核型分為1A、2A兩種，細葉美女櫻均為2A型，均是對稱性很高的類型，表明美女櫻與細葉美女櫻屬于較原始的類型[13]。過往有學者對同為馬鞭草科的海州常山[21]、蒙古蕕[22]進行核型分析，得出其核型分別為2A、2B型，同樣為較為原始的類型。

劉慧民等[23]在此基礎上對染色體核型參數的重要性進行排序，由大到小的順序為核型不對稱系數、平均臂比、臂比大于2的染色體、染色體長度比、核型類型。但核型類型由臂比大于2的染色體得出，故筆者認為核型類型與臂比大于2的染色體選擇其一作為判定進化趨勢的主要染色體參數。通過比較10個美女櫻與細葉美女櫻種(品種)的相關核型參數可知，核型不對稱系數數據由大到小的順序為‘夢幻曲’、‘石英’(粉)、‘托斯卡納’(藍)、‘石英’(紅)、‘魔力紫’、‘水晶’、‘祥和’、美女櫻(藍)、‘托斯卡納’(玫紅)、‘石英’(猩紅)；平均臂比值由大到小的順序為‘夢幻曲’、‘石英’(粉)、‘魔力紫’、‘托斯卡納’(藍)、‘石英’(紅)、‘祥和’、‘水晶’、‘石英’(猩紅)、美女櫻(藍)、‘托斯卡納’(玫紅)；染色體長度比由大到小的順序為‘夢幻曲’、美女櫻(藍)、‘托斯卡納’(藍)、‘石英’(粉)、‘石英’(紅)、‘祥和’、‘托斯卡納’(玫紅)、‘水晶’、‘石英’(猩紅)、‘魔力紫’。

平均臂比、核型不對稱系和染色體長度比是衡量染色體對稱性的主要標準，通過圖4、圖5可以看出，供試10個品種均向右上進化，兩圖整體表現出同樣的進化取向，但某些品種表現出了差異性，‘夢幻曲’進化程度均是最大，‘托斯卡納’(玫紅)、‘石英’(猩紅)則均較原始，但也有一些品種表現出了不一致，如美女櫻(藍)在染色體長度比方向顯示出較高的進化程度。邢世巖等[24]在研究中將一些種沿染色體長度比方向進化快，一些種沿平均臂比方向進化快的現象歸納為核型的“雙向進化趨勢”，美女櫻(藍)即是在染色體長度比方向的進化程度高于平均臂比方向，本研究中的細葉美女櫻與美女櫻皆呈雙向進化趨勢，美女櫻(藍)和‘托斯卡納’(玫紅)在染色體長度比方向進化快，其余品種均是在平均臂比方向進化速度快。