余鵬舉 朱天輝 萬雪琴 李姝江 王若梅 韓珊

(四川農業(yè)大學，成都，611130)

核桃(Juglansregia)又名胡桃、羌桃，屬胡桃科(Juglandaceae)核桃屬，是我國重要的“木本糧油”戰(zhàn)略樹種，有重要的經濟價值和藥用價值，但隨著核桃集約栽培程度的不斷提高和種植面積的擴大，傳統(tǒng)的粗放管理模式及品種的不當選擇導致核桃病害危害日趨嚴重，已成為核桃產業(yè)發(fā)展面臨的嚴峻問題[1-2]。其中核桃炭疽病是近年來危害核桃產業(yè)的主要病害。該病害主要為害核桃果實，引起早期落果或核桃不成實，發(fā)病重的年份可致豐產不豐收，而且感染葉片、嫩梢，病害連接成片，造成葉片、嫩梢大面積壞死。核桃炭疽病的病原菌為膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)，該病原菌在病枝、病果或土壤中越冬，翌年春季病原菌開始活動并借風、雨和昆蟲等媒介傳播。發(fā)病輕重與降雨密切相關，雨季早且降雨量大則病害發(fā)病早且嚴重。此外，水位高、株行間距小和通風透光不良也易造成病害發(fā)病嚴重和傳播蔓延[3]。由于該病具有潛伏侵染的特性，且具有發(fā)病時間集中、暴發(fā)性強等特點[2,4-5]，故選擇化學藥劑進行防治仍是當前主要對策，但發(fā)病后再進行防治，往往對核桃產量已造成較重影響。因此,亟需一種能夠在發(fā)病初期進行早期快速檢測的技術，為及時有效的防控措施提供指導。

傳統(tǒng)的炭疽病病害的診斷主要依據植株的明顯病癥和病原菌形態(tài)，操作難度大，耗時耗力，且此時病害往往已對植株造成危害，因此,快速準確的檢測技術逐步應用于炭疽病的診斷過程中。邢紅梅等采用常規(guī)PCR成功檢測出紅掌炭疽病的病原菌(C.gloeosporioides)[6]，姚錦愛等通過常規(guī)和巢式PCR對建蘭膠胞炭疽菌(C.gloeosporioides)成功進行檢測[7]。近年來，實時熒光定量PCR技術作為一項新興技術，因其較常規(guī)PCR具有更高的靈敏性、特異性以及高精確定量等優(yōu)點[8]，在植物病害研究上不斷深入，并多用于病原菌群體以及基因表達等方面的檢測[9-10]，但該技術在核桃膠胞炭疽菌檢測方面尚無研究報道。本研究針對核桃膠胞炭疽菌建立SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法，對核桃炭疽病的早期預報、定量監(jiān)測和提高經濟效益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

四川農業(yè)大學林學院森林保護病理實驗室從核桃植株上分離保存鑒定的13株核桃膠胞炭疽菌菌株；6種核桃樹其他常見病害病原菌，分別為腐爛病病原菌核桃殼囊孢(Cytosporajuglandina)、褐斑病病原菌核桃日規(guī)殼(Marssoninajuglandisn)、枝枯病病原菌胡桃楸擬莖點霉菌(Phomopsisjuglandina)、葉斑病病原菌鏈格孢菌(Alternariaalternata)、根腐病病原菌腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、果實黑斑病病原菌小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)(表1)。

表1 供試核桃膠胞炭疽菌菌株及其他常見病害病原菌

1.2 供試菌株DNA提取

所用供試菌株于PDA平板上25 ℃培養(yǎng)1周(12 h光暗交替)備用，用刀片將菌絲輕輕刮下，置滅菌研缽中用液氮研磨成粉末狀，采用CTAB法提取菌株總DNA。健康核桃植株組織及所有微生物總基因組DNA的提取使用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)，所用植株組織樣品均隨機采自四川農業(yè)大學崇州基地5～8年生健康核桃植株枝干樹皮。所有DNA樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 特異引物設計

用DNAMAN軟件對1.2中提取膠胞炭疽菌菌株DNA的PCR擴增產物的測序結果與GenBank數據庫中已登錄的炭疽屬不同種的ITS序列進行多重同源性比較，根據比對結果選取序列差異位點，用Primer Premier 6進行引物設計，篩選得特異引物：YH1:5′-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGT-3′；YH2:5′-TTTGAGGGCCTACATCAGC-3′(成都擎科梓熙生物技術有限公司合成)，預期擴增目標片段306 bp。在NCBI GenBank database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)內使用Blast初步驗證引物的特異性。

1.4 引物特異性檢測

以不同地理來源的13株核桃膠胞炭疽菌菌株所提取的總DNA、6種其他核桃植株常見病害病原菌所提取的總DNA、健康核桃植株組織及所有微生物總基因組DNA作為模板，以雙蒸水作為對照，進行常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR檢測，驗證引物特異性。

常規(guī)PCR反應體系，25 μL總體積中包含TaqDNA聚合酶12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，雙蒸水9.5 μL。反應程序為，94 ℃變性5 min；94 ℃變性1 min，68 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增后的PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠上進行分析。

實時熒光定量PCR反應體系：采用三步反應法，25 μL總體積中包含SYBR?Premix Ex TaqTMII(TAKARA SYBR?Premix Ex TaqTMII)12.5 μL，上、下游引物各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，雙蒸水6.5 μL。反應程序為，95 ℃變性30 s；95 ℃變性5 s，68 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共45個循環(huán)；最后熔融曲線，95 ℃ 10 s，然后65 ℃到95 ℃，每10 s升0.5 ℃。實時熒光定量PCR的每個樣品重復3次，通過熔解曲線判斷是否有唯一的產物峰。

1.5 引物靈敏度檢測

將1.2中提取的核桃膠胞炭疽菌DNA經1%瓊脂糖電泳，割膠，純化后得到標準品，紫外分光光度計檢測其含量及純度，并按10倍梯度稀釋為100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg·L-1，置于-20 ℃?zhèn)溆?。使用特異引物YH1/YH2進行常規(guī)PCR擴增和實時熒光定量PCR擴增，以雙蒸水作為對照，測定特異引物靈敏度。

1.6 實時熒光定量PCR標準曲線的繪制

使用EASY Dilution(TAKARA)梯度稀釋核桃膠胞炭疽菌DNA作為模板(如1.5所述)，在CFX96 Real-Time PCR Detection System上進行實時熒光定量PCR擴增，重復3次，以擴增得到的Ct值為縱坐標(Y)，以標準品模板質量對數值為橫坐標(X)，做出標準曲線，得到線性和可靠的標準曲線(R2>0.99)。

1.7 感病核桃林間樣品的定量檢測驗證

為進一步驗證建立的SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測體系的準確性和實用性，以2016—2017年從四川、陜西、湖北等地核桃林間采集的10份患有炭疽病的核桃植株組織為驗證材料，對這些來自于不同地區(qū)、不同發(fā)病部位的林間感病核桃植株樣品進行定量檢測驗證，每份樣品組織取200 mg，采用CTAB法結合植物基因組DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)提取總DNA，作為PCR反應模板，按照1.4中所述SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測體系進行定量檢測驗證，每份樣品重復3次。

2 結果與分析

2.1 引物特異性驗證

使用特異引物YH1/YH2對13株核桃膠胞炭疽菌菌株所提取的總DNA、6種核桃植株其他常見病害病原菌所提取的總DNA、健康核桃植株組織及所有微生物總基因組DNA進行PCR擴增，結果顯示：13株核桃膠胞炭疽菌總DNA樣品均擴增出306 bp目標片段，而6種核桃植株其他常見病害病原菌所提取的總DNA、健康核桃植株組織及所有微生物總基因組DNA和對照均未擴增出目標片段(圖1)。實時熒光定量PCR結果同樣顯示：該特異引物對6份核桃膠胞炭疽菌模板樣品均只有唯一的吸收峰(圖2)。因此,該引物對核桃炭疽病致病菌膠胞炭疽菌具有特異性。

M.DL2000 DNA Marker；1～13.膠胞炭疽菌；14～19.6種其他核桃常見病害病原菌，分別為Cytosporajuglandina、Marssoninajuglandis、Phomopsisjuglandina、Alternariaalternata、Fusariumsolani、Pestalotiopsismicrospora；20～23.健康核桃植株組織及所有微生物總基因組DNA；N.陰性對照。

圖1核桃膠胞炭疽菌與其他菌DNA經常規(guī)PCR擴增后的電泳結果

圖2引物YH1/YH2對核桃炭疽病病原菌實時熒光定量PCR擴增的熔解曲線

2.2 特異引物的靈敏度

利用梯度稀釋的核桃膠胞炭疽菌的標準品對特異引物進行常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR的靈敏度測定。常規(guī)PCR結果表明(圖3)，標準品質量濃度大于10-1mg·L-1的均能擴增出明顯條帶，標準品質量濃度為10-1mg·L-1的可以擴增出模糊的條帶，標準品質量濃度小于10-1mg·L-1的擴增條帶已無法準確辨別。實時熒光定量PCR條件下(圖4)，當標準品質量濃度小于等于10-3mg·L-1時，其擴增曲線的熒光值低于閥值。故常規(guī)PCR檢出標準品的最低質量濃度為10-1mg·L-1，實時熒光定量PCR可檢出標準品的最低質量濃度為10-3mg·L-1，即實時熒光定量PCR檢測方法的靈敏度是常規(guī)PCR檢測方法的100倍。

M.DL2000 DNA Marker；1～9.常規(guī)PCR反應梯度分別為100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg·L-1；N.陰性對照。

圖3常規(guī)PCR靈敏度驗證電泳結果

2.3 實時熒光定量PCR標準曲線繪制

對梯度稀釋的標準品進行實時熒光定量PCR擴增，在擴增圖譜中(圖5)，熒光值增加時對應的循環(huán)數與用于定量的標準品的濃度梯度呈負相關性，得出循環(huán)數Ct值(Y)與標準品模板質量對數值(X)的線性關系為：Y=-5.925X+32.881 4，相關系數R2=0.995，因此標準曲線可以作為后續(xù)檢測樣品的可靠定量參考。

圖4 引物YH1/YH2的實時熒光定量PCR的靈敏度檢測

圖5 實時熒光定量PCR標準曲線

2.4 林間感病核桃樣品定量檢測驗證

使用特異性引物YH1/YH2對10份林間感病核桃植株組織樣品進行實時熒光定量PCR定量檢測驗證，結果表明(表2)，10份林間感病核桃植株組織中表現(xiàn)出輕度、中度、重度癥狀的7份樣品均檢測出含有膠胞炭疽菌且含菌量可測定，含菌量最高為148.354 mg·L-1；3份無癥感病核桃植株組織樣品中只有一份測出含有膠胞炭疽菌，含菌量為0.012 mg·L-1；且病癥表現(xiàn)越明顯檢測到的含菌量質量濃度越高。所有陽性產物通過克隆、測序(成都擎科梓熙生物技術有限公司)獲得ITS序列，在NCBI GenBank database內Blast比對分析表明，與膠胞炭疽菌(GenBank登錄號為KT342872.1)序列一致性達96.0%～99.0%，進一步證明這些林間感病核桃樣品確實被核桃膠胞炭疽菌侵染。

3 討論

核桃炭疽病的林間病癥以及往年發(fā)病規(guī)律是傳統(tǒng)方法診斷核桃炭疽病的主要依據，但由于該病所具有潛伏侵染、發(fā)病急、暴發(fā)強的特點，采用傳統(tǒng)方法診斷就易造成誤診和漏診的現(xiàn)象，且依靠傳統(tǒng)方法準確診斷核桃炭疽病很大程度依賴于炭疽病的典型病癥，此時確診為核桃炭疽病再進行防治，往往已經對核桃的產量造成影響，且防治效果不佳。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，越來越多的快速檢測技術逐步應用于植物真菌病害的檢測。核糖體DNA內轉錄間隔區(qū)(ITS)既具有保守性又在種間水平上具有特異性，針對ITS區(qū)進行PCR擴增、測序及序列分析后再設計特異性引物來診斷和檢測植物病原菌已越來越被廣泛的應用[11-12]。本研究根據核桃炭疽病病原菌膠胞炭疽菌的核糖體DNA內轉錄間隔區(qū)(ITS)設計特異性引物，建立了核桃炭疽病SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測技術，并與常規(guī)PCR的靈敏度進行了比較，結果表明，實時熒光定量PCR的靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，達到10-3mg·L-1，比實時熒光定量PCR法檢測油菜菌核病菌的靈敏度1.4×10-3mg·L-1略高[13]，但比實時熒光定量PCR法檢測楊梅凋萎病菌的靈敏度10-6μg·L-1低[14]。通過對林間感病核桃樣品組織的定量檢測，也進一步驗證所建立SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測技術在監(jiān)測核桃炭疽病的實踐應用中的可靠性和實用性。

表2 林間感染炭疽病核桃樣品病原菌檢測結果

注：表中數據均為平均值±標準誤；“-”代表未檢出，“+”代表檢出。

實時熒光定量PCR具有PCR擴增的高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確定量以及較常規(guī)PCR、巢式PCR更加快速簡便等優(yōu)點，既可以做定量分析又可以做定性分析，且因無須在擴增后進行操作，如電泳檢測，大大降低了污染的可能性，提高檢測的準確性[8]?；谝陨显蚯铱紤]到實際應用中實時熒光定量PCR的經濟成本、儀器要求等問題，如何優(yōu)化本試驗針對核桃膠胞炭疽菌所建立的SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測體系，使其較常規(guī)PCR甚至巢式PCR等其他檢測技術更具有推廣適用價值，是本試驗接下來研究的主要內容。黃懷冬等通過引入常規(guī)PCR預擴增，以預擴增PCR產物為模板進行qPCR對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)進行檢測，較未引入預擴增時靈敏度提高了10倍[15]。Guoetal.在保守性好的tubB基因序列基礎上設計了病原菌(Rhizoctoniacerealis)的特異性引物，并成功構建其實時熒光定量PCR檢測體系[16]。本研究接下來將在所建立的SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測核桃炭疽病體系中加入常規(guī)PCR預擴增環(huán)節(jié)，并嘗試尋找保守性好的基因序列設計適合實時熒光定量PCR的更優(yōu)特異性引物，旨在建立針對核桃組織內炭疽病菌更為高效、靈敏的實時熒光定量PCR檢測體系。