李 南，楊秀平，周正君，鄧 鵬

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)屬于蕓香科花椒屬植物，是一種具有濃郁辛香的落葉灌木或小喬木[1-2]。作為我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)樹種，具有很高的利用價(jià)值，花椒良種選育工作對(duì)花椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展尤為重要，但花椒屬于無融合生殖植物，無融合生殖率達(dá)25%[3]，人工雜交十分困難，目前花椒遺傳改良主要依靠自然變異[4-5]，但變異率低及變異的不確定性，使得花椒種質(zhì)創(chuàng)新和良種繁育工作一直沒有取得突破性進(jìn)展。而體細(xì)胞雜交技術(shù)能夠人為融合異源植物原生質(zhì)體，培養(yǎng)雜種植株，獲得理想的優(yōu)良新種質(zhì)。因此，花椒體細(xì)胞雜交技術(shù)體系，是實(shí)現(xiàn)花椒種質(zhì)創(chuàng)新及性狀改良的一個(gè)有效途徑。而體細(xì)胞雜交的前提是原生質(zhì)體的有效分離與培養(yǎng)，但目前尚未見花椒原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)方面的報(bào)道。采用酶解法，以韓城大紅袍試管苗花椒葉片和鳳縣大紅袍花椒愈傷組織及懸浮細(xì)胞為試驗(yàn)材料，對(duì)花椒原生質(zhì)體分離條件及影響因素進(jìn)行研究，并從花椒試管苗葉片剝離的原生質(zhì)體為試驗(yàn)材料，對(duì)影響花椒原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素進(jìn)行了探究，建立了穩(wěn)定高效的花椒原生質(zhì)體分離培養(yǎng)技術(shù)體系，為體細(xì)胞雜交奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以西北農(nóng)林科技大學(xué)林木育種實(shí)驗(yàn)室保存的韓城大紅袍花椒試管苗、鳳縣大紅袍花椒愈傷組織和鳳縣大紅袍花椒細(xì)胞懸浮系為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體分離及純化 酶液用CPW[6]溶液配制，以甘露醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑，加入5 mmol·L-1MES(2,N-瑪琳-乙基磺酸)作為pH穩(wěn)定劑，pH 5.8，以2 000 r·min-1離心1 min，取上層清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾滅菌。

分別稱取0.4 g葉片、愈傷組織或懸浮細(xì)胞，放入裝有4 mL含有不同濃度纖維素酶和果膠酶組合的混合酶液中酶解10 h，酶解溫度為(27±1)℃，置于50 r·min-1的搖床中暗處理。分別對(duì)酶液濃度(w/v)(纖維素酶R-10：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，果膠酶：0.5%、1.0%、1.5%)和甘露醇濃度(0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mol·L-1)2個(gè)因素設(shè)置不同水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每試驗(yàn)重復(fù)3次。

酶解結(jié)束后，將酶解液中加入4 mL CPW的13%甘露醇溶液，依次通過100目和400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去未酶解的材料及大細(xì)胞團(tuán)，然后將濾液轉(zhuǎn)至10 mL的離心管中離心 10 min，轉(zhuǎn)速500 r·min-1。原生質(zhì)體沉于管底，吸去上清液，加2 mL CPW的13%甘露醇溶液重新懸浮原生質(zhì)體，在底部加入6 mL CPW的26%蔗糖溶液，以300 r·min-1離心3 min，原生質(zhì)體在蔗糖與甘露醇兩液面間形成一條清晰的帶，吸出原生質(zhì)體帶，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中，加入1 mL WPM培養(yǎng)基，以500 r·min-1離心10 min沉淀原生質(zhì)體，吸去上清液，獲得純凈原生質(zhì)體，隨后用1 mL WPM培養(yǎng)基懸浮。用血球板計(jì)數(shù)法[7]計(jì)算產(chǎn)量，用FDA染色法[8]測(cè)定原生質(zhì)體活力。

1.2.2 原生質(zhì)體培養(yǎng) 用1.2中韓城大紅袍葉片中分離的原生質(zhì)體調(diào)至5×105個(gè)·mL-1，分別接種到WPM、MS、B5和T進(jìn)行液體淺層法培養(yǎng)(培養(yǎng)液中以甘露醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑，甘露醇初始濃度為0.6 mol·L-1，pH 5.8)。在直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中加入2 mL原生質(zhì)體懸浮液，用Parafilm封住培養(yǎng)皿的口，置于轉(zhuǎn)速為100 r·min-1搖床中25℃暗培養(yǎng)。比較不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)密度、激素組合等對(duì)原生質(zhì)體再生細(xì)胞分裂的影響。

每周添加1次新鮮培養(yǎng)基，甘露醇濃度從0.6 mol·L-1降至0.4 mol·L-1，再降至0.2 mol·L-1，再形成2 mm左右的愈傷組織后轉(zhuǎn)至MS+2,4-D 0.1 mol·L-1+NAA 1.5 mol·L-1+6-BA 0.5 mol·L-1的固體培養(yǎng)基中。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒原生質(zhì)體分離及純化

2.1.1 酶液濃度對(duì)花椒原生質(zhì)體分離的影響 通過原生質(zhì)體活力與產(chǎn)量的統(tǒng)計(jì)表明，酶液濃度對(duì)花椒原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力有顯著影響(表1)。以葉片為分離材料時(shí)，同一果膠酶濃度下，隨著纖維素酶R-10濃度的提高，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均表現(xiàn)為先升高后下降，纖維素酶濃度為1.5%(w/v)時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量高，以1.5%(w/v)纖維素酶R-10+1.5%(w/v)果膠酶處理產(chǎn)量最高，達(dá)99.99×105個(gè)·g-1，但酶解碎片多，原生質(zhì)體活力較低，為59.98%；當(dāng)纖維素酶R-10濃度不變時(shí)，隨著果膠酶濃度提高，原生質(zhì)體產(chǎn)量增加，但活力下降。當(dāng)酶液濃度為1.0%(w/v)纖維素酶R-10+1.5%(w/v)果膠酶時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均較高，分別達(dá)81.51×105個(gè)·g-1和72.28%。

以愈傷組織為分離材料時(shí)，隨酶液濃度的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)纖維素酶R-10濃度為2%(w/v) +0.5%(w/v)果膠酶時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量最大，產(chǎn)量達(dá)31.16×105個(gè)·g-1(活力58.09%)。隨著酶濃度增加，原生質(zhì)體的活力呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)酶液濃度為1.5%(w/v)纖維素酶R-10+0.5%(w/v)果膠酶時(shí)，原生質(zhì)體活力最大，為62.84%，但產(chǎn)量較低，僅為15.69×105個(gè)·g-1。

以懸浮細(xì)胞為分離材料時(shí)，不同果膠酶濃度下隨著纖維素酶R-10濃度的提高，原生質(zhì)體產(chǎn)量均有所增加，活力則表現(xiàn)為先升高后下降。當(dāng)酶液濃度為1.5%(w/v)纖維素酶R-10+0.5%(w/v)果膠酶時(shí)活力最大，為65.69%(產(chǎn)量30.80×105個(gè)·g-1)；酶液濃度為2.0%(w/v)纖維素酶R-10+0.5%(w/v)果膠酶時(shí)產(chǎn)量最大，為55.61×105個(gè)·g-1(活力63.55%)。

綜合考慮原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響，花椒葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離的最佳酶液濃度為1.0%(w/v)纖維素酶R-10+1.5%(w/v)果膠酶，愈傷組織和懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體分離的最佳酶液濃度為2.0%(w/v)纖維素酶R-10+0.5%(w/v)果膠酶。

表1 酶液濃度對(duì)花椒原生質(zhì)體分離的影響

注：采用Duncan's 新復(fù)極差法測(cè)驗(yàn)(LSR)，同列不同小寫字母表示不同處理間差異達(dá)到α=0.05顯著水平。

2.1.2 甘露醇濃度對(duì)花椒原生質(zhì)體分離的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，甘露醇濃度過低或過高，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均較低(圖1)，花椒葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離的最佳甘露醇濃度為0.7 mol·L-1，花椒愈傷組織和懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體分離的最佳甘露醇濃度為0.6 mol·L-1。

甘露醇濃度0.4～0.5 mol·L-1時(shí)，花椒葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力都較低；0.6～0.7 mol·L-1時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力大幅提高，甘露醇濃度為0.7 mol·L-1時(shí)，產(chǎn)量和活力均達(dá)到最大值，分別為80.45×105個(gè)·g-1和73.59%；0.8～0.9 mol·L-1時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力迅速下降，至0.9 mol·L-1時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力僅為27.71×105個(gè)·g-1和47.94%。

甘露醇濃度0.4～0.5 mol·L-1時(shí)，懸浮細(xì)胞和愈傷組織細(xì)胞原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力逐漸增大，當(dāng)甘露醇濃度為0.6 mol·L-1時(shí)，產(chǎn)量和活力達(dá)到最大值，隨后逐漸下降。甘露醇濃度為0.9 mol·L-1時(shí)，懸浮細(xì)胞分離的原生質(zhì)體活力較甘露醇濃度為0.6 mol·L-1時(shí)下降了53.59%，而愈傷組織細(xì)胞原生質(zhì)體活力下降了35.84%，表明高滲壓溶液對(duì)懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體影響大。

2.2 花椒原生質(zhì)體培養(yǎng)

2.2.1 培養(yǎng)基種類對(duì)花椒原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響 將原生質(zhì)體用培養(yǎng)液調(diào)至1×105個(gè)·mL-1，不添加任何激素，進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)。結(jié)果表明(表2)，在MS作為基本培養(yǎng)基時(shí)，不能觀察到細(xì)胞分裂，大部分細(xì)胞破碎死。當(dāng)B5、WPM、T作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，原生質(zhì)體第1次細(xì)胞分裂時(shí)間相同，均在3 d后原生質(zhì)體進(jìn)行第1次分裂，但細(xì)胞分裂率及形成細(xì)胞團(tuán)所需時(shí)間有所不同。2個(gè)月后，僅有WPM培養(yǎng)基中的細(xì)胞團(tuán)可形成2 mm左右的愈傷組織。因此，WPM是進(jìn)行花椒原生質(zhì)體培養(yǎng)較好的培養(yǎng)基。

2.2.2 不同激素組合對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響 將原生質(zhì)體用培養(yǎng)液調(diào)至1×105個(gè)·mL-1，以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用了L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表3)，比較了6-BA、NAA、2,4-D對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響。

試驗(yàn)結(jié)果表明(表4)，花椒原生質(zhì)體在0.5 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA與1.0 mg·L-12,4-D+1.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上能夠分裂。分裂頻率以1.0 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA較高，在第2天即可見原生質(zhì)體分裂，4～6 d后形成2～4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，但細(xì)胞就此停止分裂，并在培養(yǎng)基中出現(xiàn)了褐化的沉淀物。而在0.5 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基中可持續(xù)分裂。因此，0.5 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA是進(jìn)行花椒原生質(zhì)體較好的激素配比。

圖1 甘露醇濃度對(duì)花椒原生質(zhì)體分離的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基第1次分裂時(shí)間/d15 d后原生質(zhì)體分裂頻率/%28 d后細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)頻率/%MS---WPM36.352.01B533.410.09T30.09-

表3 花椒原生質(zhì)體L9(33)正交試驗(yàn)的因素與水平

2.2.3 培養(yǎng)密度對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響 以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不添加任何激素，將原生質(zhì)體密度分別調(diào)至0.5×105個(gè)·mL-1、1×105個(gè)·mL-1、5×105個(gè)·mL-1、10×105個(gè)·mL-1進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)。結(jié)果表明(表5)，不同培養(yǎng)密度對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)具有較大的影響，過高或過低，都會(huì)抑制原生質(zhì)體的發(fā)育。當(dāng)培養(yǎng)密度<1×105個(gè)·mL-1時(shí)，盡管前期發(fā)生少量細(xì)胞分裂，但形成細(xì)胞團(tuán)數(shù)量極小，后期細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢或停止生長(zhǎng)；當(dāng)培養(yǎng)密度為1×105個(gè)·mL-1時(shí)，分裂頻率較低，但原生質(zhì)體能夠持續(xù)分裂；當(dāng)培養(yǎng)密度達(dá)5×105個(gè)·mL-1時(shí)，分裂頻率較高，但分裂1～3次后則停止分裂，并且原生質(zhì)體有破碎現(xiàn)象；而在1×106個(gè)·mL-1培養(yǎng)密度下，原生質(zhì)體破碎、褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，未見分裂。因此試驗(yàn)中培養(yǎng)密度為1×105個(gè)·mL-1是適宜花椒原生質(zhì)體較好的培養(yǎng)密度。

表4 不同植物生長(zhǎng)激素組合對(duì)花椒原生質(zhì)體的影響

表5 培養(yǎng)密度對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

建立穩(wěn)定高效的原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)體系，是原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞雜交的基礎(chǔ)[9]。本文以韓城大紅袍花椒葉片和鳳縣大紅袍花椒愈傷組織及懸浮細(xì)胞為原生質(zhì)體試驗(yàn)的起始材料，對(duì)影響花椒原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的因素進(jìn)行系統(tǒng)研究。初步探究了花椒原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)的最佳條件。

纖維素酶和果膠酶常作為植物原生質(zhì)體分離的酶制劑，不同植物種類和分離材料所用的酶制劑濃度各不相同。例如：D.Chabane[10]等用于分離椰棗葉片酶液濃度是1.5%(w/v)纖維素酶+0.15%(w/v)果膠酶Y-23+0.2%半纖維素酶，王歡[11]等用于分離刺槐愈傷組織的酶液濃度為2.5%(w/v)纖維素酶R-10+0.6%(w/v)果膠酶Y-23+1%(w/v)離析酶R-10。

在植物原生質(zhì)體分離過程中，甘露醇常作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，濃度過高會(huì)使原生質(zhì)體失水皺縮，濃度過低會(huì)使原生質(zhì)體過度吸水脹裂死亡，因此適宜濃度的甘露醇對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力具有重要意義[12-14]。本試驗(yàn)中甘露醇濃度為0.7 mol·L-1時(shí)，花椒葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力最高，這與R.Rezazadeh[15]等對(duì)芒果原生質(zhì)體分離研究結(jié)果相一致；甘露醇濃度為0.6 mol·L-1時(shí)，花椒愈傷組織和懸浮細(xì)胞分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力最高，這與王鵬凱[16]等對(duì)北美鵝掌楸原生質(zhì)體的分離研究結(jié)果相同。

本試驗(yàn)在無激素的WPM培養(yǎng)的原生質(zhì)體在液體淺層培養(yǎng)基中形成了新的愈傷組織，其他方式培養(yǎng)的原生質(zhì)體均無分裂或僅形成數(shù)十個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)后便解體。原生質(zhì)體培養(yǎng)受培養(yǎng)基種類、原生質(zhì)體密度、外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等多種因素的影響，而培養(yǎng)基的種類直接影響到原生質(zhì)體的培養(yǎng)。不同種類的植物所用的培養(yǎng)基不相同，很多木本植物都采用MS培養(yǎng)基，如楊樹和野生梨等。也有一些使用富有機(jī)營(yíng)養(yǎng)的KM8P培養(yǎng)基，如榆樹和牛蹄豆樹[17]。

外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)木本植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)也是非常重要的，一般包括生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類。各類樹種對(duì)激素的種類和濃度要求有所不同。例如，何業(yè)畢[18]等分離出棗樹原生質(zhì)體用NAA進(jìn)行培養(yǎng)，馬鋒旺[19]等分離出的中國(guó)李原生質(zhì)體則用2,4-D和6-BA培養(yǎng)效果較好。馬鋒旺[20-21]等在培養(yǎng)杏的原生質(zhì)體時(shí)，發(fā)現(xiàn)使用2,4-D培養(yǎng)效果優(yōu)于NAA，但2,4-D必須和BA配合使用才能啟動(dòng)原生質(zhì)體進(jìn)行分裂。但柑桔原生質(zhì)體在不加任何外源激素的情況下就能分裂形成多細(xì)胞團(tuán)，添加了植物激素NAA和BA反而對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)有抑制作用[22]。

原生質(zhì)體培養(yǎng)密度對(duì)其生長(zhǎng)影響很大。在適宜的密度范圍內(nèi)植物原生質(zhì)體才能正常分裂與發(fā)育。密度過高時(shí)，會(huì)因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)不足或細(xì)胞代謝物過多而妨礙細(xì)胞的正常生長(zhǎng)；當(dāng)密度過低時(shí)，會(huì)使與分裂有關(guān)的物質(zhì)達(dá)不到一定的濃度而使再生細(xì)胞不能持續(xù)分裂。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)花椒原生質(zhì)體的培養(yǎng)密度在0.5×105個(gè)·mL-1與1 ×105個(gè)·mL-1時(shí)，由于密度偏低，原生質(zhì)體很難分裂，而密度在10×105個(gè)·mL-1時(shí)，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，原生質(zhì)體多數(shù)死亡，原因可能是密度過高，在培養(yǎng)是產(chǎn)生了一些不利于原生質(zhì)體的有害物質(zhì)使得原生質(zhì)體無法分裂。

本研究建立的花椒原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)體系，為花椒體細(xì)胞雜交奠定了基礎(chǔ)，為花椒種質(zhì)進(jìn)一步創(chuàng)新和品質(zhì)改良提供了新的途徑，對(duì)植物細(xì)胞工程在花椒種質(zhì)資源創(chuàng)新工作中的應(yīng)用具有重要的意義。但是，研究還需要進(jìn)一步探索，主要包括對(duì)不同基因型的材料進(jìn)行研究，對(duì)原生質(zhì)體的分裂頻率較低和形成細(xì)胞團(tuán)的頻率低的原因進(jìn)行探究等。