巫曉燕，蔡為榮

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

低聚糖(Oligosaccharide)主要存在于多種植物中，人體攝入后很難被吸收[1-2],有甜味，可在食品加工中作為添加劑使用，制作的食品熱量低，更健康[3-5]．功能性低聚糖主要有低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚木糖等[6]，目前對(duì)果膠低聚糖(POS)的研究不多．果膠低聚糖廣泛存在于植物的果皮中，是容易獲得的功能性低聚糖，它們通常由酶解法、化學(xué)合成法、物理法等制備[7-9]．孫麗娜[10]等篩選出最佳的果膠酶，并且以該果膠酶酶解果膠制備了聚合度1～2的低聚糖混合物，眾多學(xué)者利用化學(xué)法進(jìn)行了研究，此法可以獲得聚合度單一的寡聚半乳糖醛酸[11-12]．研究采用酶解法制備果膠低聚糖,可以獲得低聚合度的果膠低聚糖．目前分離純化果膠低聚糖的方法包括分級(jí)醇沉法、微生物發(fā)酵法、色譜柱分離法、超濾膜分離法等[13]．研究選用超濾裝置，分離效率更高、能耗比較低、易于操作，在未來(lái)糖類(lèi)物質(zhì)分離純化的研究上應(yīng)用更加廣泛．

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是人體腸道中最重要的有益細(xì)菌，主要存在于人體的大腸，對(duì)人體有多種保健功能[14-15]．普通人腸道中常見(jiàn)的雙歧桿菌有兩歧雙歧桿菌(B.amphibius)、青春雙歧桿菌(B.adolescentis)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)、長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)和短雙歧桿菌(B.breve)[16]．

青春雙岐桿菌(B.adolescentis)具有很強(qiáng)的耐酸、耐氧性，對(duì)人體胃酸和膽堿有較強(qiáng)的適應(yīng)力．采用微囊化技術(shù)，可大大降低胃酸、膽堿對(duì)有益菌的傷害，順利到達(dá)胃腸道，對(duì)低聚糖的微膠囊化制備具有實(shí)際的研究意義．選擇青春雙歧桿菌作為唯一菌種，對(duì)雙歧桿菌的益生作用進(jìn)行代表性研究．目前發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌的有益作用包括以下幾個(gè)方面：治療慢性腹瀉與抗生素相關(guān)性腹瀉；有效緩解便秘；抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展；保護(hù)肝臟；促進(jìn)人體對(duì)乳糖的消化；營(yíng)養(yǎng)作用[17-20]．

柑橘皮是生產(chǎn)果膠低聚糖的有效來(lái)源，利用果膠酶將柑橘果膠分解，通過(guò)超濾膜過(guò)濾后得到不同分子量范圍果膠低聚糖．由柑橘皮制備的雙歧因子果膠低聚糖在腸道中具備消化性，是生產(chǎn)第二代雙歧因子的極佳選擇[21]．

采用超濾膜分離成為3種不同組分的果膠低聚糖，分子截留量分別為3 KDa、5 KDa、10 KDa．在體外厭氧條件下，研究了低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌增殖的影響，并對(duì)其基本發(fā)酵性質(zhì)進(jìn)行了研究．

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

果膠低聚糖：由柑橘果膠通過(guò)酶法實(shí)驗(yàn)室制備．果膠裂解酶(酶活≥600 U/mL)(夏盛食品有限公司)．菌種：青春雙歧桿菌(B.adolescentis)(江南大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供)．試劑：DNS試劑[22]；溶菌酶(美國(guó)BBI公司)；乙醇；濃硫酸；氫氧化鈉．

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

臺(tái)式高速離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器)； W-CJ-2F型超凈工作臺(tái)(北京佳源興業(yè)有限公司)；超濾設(shè)備(MiLipore公司)；SYQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱(上海佰好儀器有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械有限公司)；筆試酸度計(jì)(深圳市宇輝科技有限公司)．

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酶法制備果膠低聚糖

參照李拖平[23]等實(shí)驗(yàn)稍作修改，果膠可被果膠酶分解成多個(gè)低聚半乳糖醛酸，在強(qiáng)酸條件下被分解為半乳糖醛酸單糖．

①向配制好的果膠溶液中加入果膠內(nèi)切酶；②反應(yīng)一段時(shí)間后，可得到多糖、低聚糖和單糖的混合液；③將上述溶液中加入80%乙醇，沉析、過(guò)夜后置于離心機(jī)中離心15 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min；④完成后，上清液為單糖、低聚糖的混合液，沉淀為多糖混合物[24]．

2.2 計(jì)算果膠低聚糖得率

吸取1.0 mL含有單糖和果膠低聚糖的清液，加入1.0 mL質(zhì)量濃度為1.5 mol/L的硫酸，沸水浴90 min，再加1.0 mL質(zhì)量濃度為3.0 mol/L氫氧化鈉溶液中和，加入3.0 mL DNS試劑，把同體積1.0 mL未酸解清液稀釋3倍，作為空白對(duì)照．依照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，于630 nm處測(cè)OD值，得半乳糖醛酸含量，計(jì)算低聚糖得率．

式中,a為OD對(duì)應(yīng)還原糖(μg/mL)；b為稀釋倍數(shù)；V1為乙醇提取的溶液總體積(mL)；c為底物的摩爾濃度(μmoL/mL)；V2為酶促反應(yīng)液底物體積(mL)；M為半乳糖醛酸相對(duì)摩爾質(zhì)量(μg/umol)．

2.3 果膠低聚糖的超濾分級(jí)

將分子截留量為10 KDa的膜組件組裝好，超濾條件為：壓力0.020 Mpa，果膠低聚糖溶液溫度35 ℃，果膠質(zhì)量濃度1 g/L；將果膠低聚糖溶液通過(guò)超濾膜，分子量小于10 KDa的果膠低聚糖在壓力作用下透過(guò)超濾膜流出．保留液返回，分子量小于10 kDa的果膠低聚糖溶液循環(huán)穩(wěn)定后方可得到；再將分子量小于10 KDa的低聚糖溶液依次通過(guò)分子量為5 KDa和3 KDa的超濾膜，操作步驟同上，得到POS1(分子量<3 KDa)，POS2(分子量3～5 KDa)，POS3(分子量5～10 KDa)的低聚糖溶液，冷凍干燥，備用．

2.4 厭氧培養(yǎng)青春雙歧桿菌

(1)配制培養(yǎng)基.活化培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g，牛肉膏10.0 g，蛋白胨10.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，吐溫-80 1.0 mL，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，葡萄糖10 g，pH 6.5±0.1；增殖培養(yǎng)基：以果膠、果膠低聚糖替換種子培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分同種子培養(yǎng)基．

(2)青春雙歧桿菌的活化、增殖.活化培養(yǎng)：取-80 ℃保存的青春雙歧桿菌凍干菌，接種至活化培養(yǎng)基中，放置于厭氧培養(yǎng)箱中(90% N2，5% CO2，5% H2)，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h．挑取菌落于0.85%的無(wú)菌生理鹽水中，經(jīng)過(guò)梯度稀釋配成菌懸液(濃度為1×106～1×108CFU/mL)，4 ℃冰箱中保存．增殖培養(yǎng):取9 mL增殖培養(yǎng)基置于具塞螺紋試管，121 ℃條件下滅菌25 min，趁熱旋緊螺蓋并轉(zhuǎn)入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，于 37 ℃條件下，接入2%青春雙歧桿菌，在37±1 ℃條件下嚴(yán)格厭氧靜置培養(yǎng)．

2.5 發(fā)酵性質(zhì)的研究

通過(guò)無(wú)菌手套在厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)操作．

(1)發(fā)酵液pH的測(cè)定.分別在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h、48 h時(shí)間點(diǎn)吸取發(fā)酵液樣品，用筆試酸度計(jì)在室溫下自動(dòng)測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)3次，取平均值，繪制pH曲線．

(2)繪制青春雙歧桿菌生長(zhǎng)曲線.將活化選育的青春雙歧桿菌接種到MRS液體增殖培養(yǎng)基中，分別在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h、48 h時(shí)間點(diǎn)吸取發(fā)酵液樣品，于600 nm下測(cè)吸光度，以葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，繪制果膠低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)曲線．

(3)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線.取6支試管編號(hào)，依次加入1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，蒸餾水和DNS試劑．搖勻，沸水浴15 min．放置冷卻至室溫，加入適量蒸餾水稀釋到25 mL，混勻．0管在540 nm處做空白對(duì)照，分光光度計(jì)測(cè)1～5管OD值．

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

(4)青春雙歧桿菌基質(zhì)消耗曲線的測(cè)定.青春雙歧桿菌發(fā)酵液分別在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h以及48 h收集．測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液中的含糖量，繪制曲線．(方法同2.5(3))．

(5)果膠低聚糖增殖青春雙歧桿菌.基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別以果膠、果膠低聚糖作為唯一碳源，接種活化后的青春雙歧桿菌到厭氧培養(yǎng)箱在37 ℃培養(yǎng)(2%接種量)，以無(wú)糖培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照．分別測(cè)定0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h、48 h的吸光度值，繪制生長(zhǎng)曲線．Degawa Y[25]等利用PI值作為益生菌益生作用的評(píng)價(jià)指標(biāo)，為進(jìn)一步比較果膠組分對(duì)青春雙歧桿菌增殖的影響，采用48 h發(fā)酵液吸光度法(波長(zhǎng)600 nm)計(jì)算益生指標(biāo)PI，計(jì)算PI高于0.5表示增殖作用明顯．

式中，AP0、AP48為添加果膠、果膠低聚糖發(fā)酵青春雙歧桿菌0 h和48 h的吸光度；AG0、AG48為添加葡萄糖發(fā)酵青春雙歧桿菌0 h和48 h的吸光度；AC0、AC48為無(wú)糖培養(yǎng)基0 h和48 h的吸光度．

3 結(jié)果與分析

3.1 培養(yǎng)青春雙歧桿菌發(fā)酵液pH和生長(zhǎng)曲線圖

青春雙歧桿菌pH及其生長(zhǎng)曲線如圖1所示.由圖1可知，0～6 h,處于適應(yīng)期，pH下降，生長(zhǎng)緩慢；6～24 h,處于對(duì)數(shù)期,生長(zhǎng)迅速；24～48 h，生長(zhǎng)趨于平緩，pH逐漸穩(wěn)定．研究選擇48 h作為青春雙歧桿菌發(fā)酵的終點(diǎn)．從pH曲線可以看出，發(fā)酵液的pH持續(xù)降低，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生了某些酸性代謝物，可降低腸道pH，抑制腸道腐敗菌生長(zhǎng)，有益于宿主的健康．

圖1 青春雙歧桿菌pH及其生長(zhǎng)曲線

3.2 青春雙歧桿菌還原糖消耗曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，回歸方程為y=0.680 5x-0.034，R2=0.999 5，說(shuō)明以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品在測(cè)量范圍內(nèi)滿(mǎn)足測(cè)定的要求，可用于計(jì)算還原糖含量．用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定以果膠低聚糖為唯一碳源的青春雙歧桿菌培養(yǎng)基在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h和48 h的吸光度值，根據(jù)上述回歸方程可計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基中的還原糖含量，繪制青春雙歧桿菌基質(zhì)消耗曲線如圖3所示．由圖3可知，青春雙歧桿菌在適應(yīng)期，還原糖消耗較慢，處于對(duì)數(shù)期，還原糖消耗明顯增多，在24 h之后還原糖消耗速率逐漸加快，最終的殘?zhí)呛繛?.453 mg/mL．

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖3 青春雙歧桿菌基質(zhì)消耗曲線

3.3 果膠及果膠低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌的增殖影響

果膠及果膠低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌的增殖影響如圖4所示.由圖4可以看出，果膠、果膠低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌均具備較好的增殖作用，但相對(duì)而言，果膠低聚糖的增殖效果更好，且分子量越小，增殖效果越好．總體來(lái)看，在4～12 h，青春雙歧桿菌快速生長(zhǎng)，在24 h之后，青春雙歧桿菌的生長(zhǎng)趨于平緩．

3.4 青春雙歧桿菌發(fā)酵48 h的PI值

青春雙歧桿菌發(fā)酵48 h的PI值如圖5所示.由圖5可以看出，添加果膠低聚糖的青春雙歧桿菌發(fā)酵液的PI值達(dá)到0.5以上，而以果膠作為碳源的青春雙歧桿菌發(fā)酵液的PI值不超過(guò)0.3．由此可以看出，果膠水解后的益生作用變好(PI值增高)，且分子量越小，越有利于促進(jìn)青春雙歧桿菌的增殖．

圖4 果膠及果膠低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌的增殖影響 圖5 青春雙歧桿菌發(fā)酵48 h的PI值

4 結(jié)論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，在體外模擬實(shí)驗(yàn)中，果膠低聚糖能有效促進(jìn)青春雙歧桿菌的增殖，且低分子量的增殖效果更好．在厭氧培養(yǎng)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了酸性代謝產(chǎn)物，可以降低腸道pH值，同時(shí)抑制腸道腐敗菌的生長(zhǎng)，有利于宿主的健康．但體外實(shí)驗(yàn)難以很好地模擬復(fù)雜的人體腸道環(huán)境，只能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行初步測(cè)試．要想得出準(zhǔn)確、完善的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，就要認(rèn)真進(jìn)行下一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)．