宋媛媛 劉二勇 陶波山 黃費湘 肖亞利 藍如束 譚云洪 李輝 葉磊 成詩明 趙雁林

結(jié)核病細菌學(xué)診斷的“金標準”是培養(yǎng)法，其既是結(jié)核病最可靠的檢測方法，也是獲得陽性培養(yǎng)物進行菌種鑒定、藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)及分子生物學(xué)檢測研究的基礎(chǔ)。目前，公認的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方法有2種，即快速液體培養(yǎng)法和固體羅氏培養(yǎng)法。快速液體培養(yǎng)法檢測結(jié)果報告的時間快，陽性結(jié)果報告時間一般為10～20 d，陰性結(jié)果報告時間為42 d，但其價格昂貴，需要特殊儀器，在基層醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)使用受到一定的限制。固體羅氏培養(yǎng)法是傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，也是我國普遍應(yīng)用的分枝桿菌培養(yǎng)方法，報告結(jié)果的時間較長，一般陽性結(jié)果報告時間為20～30 d，陰性結(jié)果報告時間為56 d。其價格低廉，能在縣(區(qū))級基層醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)使用。

分枝桿菌雙相羅氏培養(yǎng)基(簡稱“雙相培養(yǎng)基”)是一種能促進分枝桿菌快速生長的新型培養(yǎng)基，陰性結(jié)果報告時間為42 d。其結(jié)合了改良羅氏培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基的優(yōu)點，分枝桿菌可在培養(yǎng)基的固體斜面上形成典型的菌落，同時又因為含有顯色劑，在液體培養(yǎng)基中呈現(xiàn)粉紅色或紅色顆粒狀生長。為探討該培養(yǎng)基在基層實驗室推廣應(yīng)用的可行性，筆者選取我國3個省的3個地市級結(jié)核病診療機構(gòu)，采用多中心試驗方法評價該培養(yǎng)基在結(jié)核病診斷中的價值。

材料和方法

1.研究對象：連續(xù)納入2014年10月至2015年10月在廣西壯族自治區(qū)北海市結(jié)核病防治院、湖南省邵陽市結(jié)核病防治醫(yī)院、河南省南陽市第六人民醫(yī)院就診的初診肺結(jié)核可疑癥狀者作為研究對象，共計2320例。其中，肺結(jié)核患者1176例，非肺結(jié)核患者1144例；其中，男1536例(66.21%)，女784例(33.79%)；最小年齡10歲，最大年齡104歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]為50(33, 63)歲；其中15例因分枝桿菌改良羅氏培養(yǎng)基(簡稱“羅氏培養(yǎng)基”)和雙相培養(yǎng)基中的1種或2種培養(yǎng)污染或結(jié)果缺失，故在兩種培養(yǎng)基檢測結(jié)果進行比較時不計入分析。由接受過培訓(xùn)的臨床醫(yī)生詢問研究對象的基本信息、本次就診癥狀及病史，并結(jié)合細菌學(xué)檢查和X線胸部攝影(簡稱“胸片”)結(jié)果，參考《WS 288—2008 肺結(jié)核診斷標準》[1]診斷肺結(jié)核患者。每例患者均有胸片，并均留取3份痰標本(即時痰、夜間痰、晨痰)進行萋-尼染色法涂片鏡檢(簡稱“涂片”)，并選取2份性狀好的痰標本同時進行羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.試劑及培養(yǎng)基：萋-尼染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。羅氏培養(yǎng)基購自河南省賽諾特生物技術(shù)有限公司，由7 ml改良羅氏培養(yǎng)基組成，陰性結(jié)果觀察至第8周報告。雙相培養(yǎng)基購自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司，由固體和液體兩部分組成；固體部分含有7 ml國內(nèi)外通用的改良羅氏培養(yǎng)基成分，液體部分由3 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基、促生長劑、抑菌劑和顯色劑組成；陰性結(jié)果觀察至第6周報告。

3.涂片鏡檢：萋-尼染色法涂片鏡檢遵照《痰涂片顯微鏡檢查標準化操作及質(zhì)量保證手冊》[2]中的標準化操作程序執(zhí)行。

4.痰標本前處理方法及培養(yǎng)：采用中和離心法對同一份痰標本進行去污染處理，分別接種0.1～0.15 ml在羅氏培養(yǎng)基和雙相培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，遵照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[3]中的標準化操作程序執(zhí)行。

5.質(zhì)量保證：(1)制定項目實驗室標準化操作程序手冊及質(zhì)量保證手冊。(2)研究人員統(tǒng)一經(jīng)過培訓(xùn)合格。(3)國家級和省級疾控中心(結(jié)核病防治所)對項目點每3個月進行1次督導(dǎo)。(4)每月進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，包括標本量、陽性率、涂陽培陽率、涂陽培陰率、污染率。

6.統(tǒng)計學(xué)處理：使用SPSS 24.0軟件，采用配對χ2檢驗比較兩種培養(yǎng)基的陽性檢出率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；分別以羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果、臨床診斷為標準對雙相培養(yǎng)基的檢測效能進行評價；采用Wilcoxon秩和檢驗對羅氏培養(yǎng)基與雙相培養(yǎng)基檢出時間的差異進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.陽性檢出率：在初診肺結(jié)核可疑癥狀者中，涂片陽性率為15.30%(355/2320)； 羅氏培養(yǎng)基和雙相培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)方法陽性檢出率分別為19.65%(453/2305)和22.00%(507/2305)，后者較前者高2.34%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.091，P=0.000)。在臨床診斷的肺結(jié)核患者中，涂片陽性率為30.19%(355/1176)；涂片加羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率為43.11%(507/1176)；涂片加雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率為46.34%(545/1176)。

2.以羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為標準對雙相培養(yǎng)基檢測效能的評價：雙相培養(yǎng)基的敏感度為91.39%(414/453)，特異度為94.98%(1759/1852)，一致率為94.27%(2173/2305)(表1)。假陰性率為8.61%(39/453)，假陽性率為5.02%(93/1852)。在雙相培養(yǎng)基檢測出現(xiàn)假陰性的39例患者中，有24例涂片結(jié)果為陰性，8例涂片結(jié)果為1～8條/300個視野或+；有15例羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為實際菌落數(shù)，13例羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為+；在雙相培養(yǎng)基檢測出現(xiàn)假陽性的93例患者中，雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果均為實際菌落數(shù)。

3.以臨床診斷為標準評價羅氏培養(yǎng)基和雙相培養(yǎng)基的診斷價值：羅氏培養(yǎng)基診斷肺結(jié)核患者時ROC曲線下面積為0.694(95%CI：0.672～0.715)，與完全無價值的診斷試驗曲線下面積0.5相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=17.636,P=0.000),診斷價值較低。雙相培養(yǎng)基診斷肺結(jié)核患者時ROC曲線下面積為0.707(95%CI：0.685～0.728)，與完全無價值的診斷試驗曲線下面積0.5相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=18.818,P=0.000),診斷價值中等。對兩種培養(yǎng)基的曲線下面積進行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.836，P=0.403)(圖1)。

圖1 以臨床診斷為標準，羅氏培養(yǎng)基和雙相培養(yǎng)基診斷肺結(jié)核患者的ROC曲線

4.羅氏培養(yǎng)基與雙相培養(yǎng)基報陽時間分析：羅氏培養(yǎng)基報陽時間中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]為28(21,34) d，雙相培養(yǎng)基報陽時間M(Q1,Q3)為18(14,24) d，雙相培養(yǎng)基比羅氏培養(yǎng)基報陽時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=15.114，P=0.000)。不同涂片結(jié)果使用雙相培養(yǎng)基較羅氏培養(yǎng)基報陽時間均明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表1 以羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為標準對雙相培養(yǎng)基檢測效能的評價

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%

表2 不同涂片結(jié)果使用羅氏培養(yǎng)基和雙相培養(yǎng)基報陽時間比較

討 論

在結(jié)核病防治工作中快速診斷結(jié)核病至關(guān)重要，診斷結(jié)核病的金標準是培養(yǎng)法。據(jù)文獻報道雙相培養(yǎng)基、加入不同營養(yǎng)物的固體培養(yǎng)基、各類液體培養(yǎng)基與羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果相比，陽性檢出率提高分別在0.8%～7.2%[4-6]、1.6%～7.1%[7-9]、0.4%～7.5%[10-14]之間。本研究雙相培養(yǎng)基較羅氏培養(yǎng)基陽性檢出率提高2.34%，與文獻報道相符。雙相培養(yǎng)基液體部分可達到快速培養(yǎng)的目的，固體部分可提供分枝桿菌典型菌落，體現(xiàn)了雙相培養(yǎng)基的優(yōu)點[15]；一般的液體培養(yǎng)基陽性菌落呈白色顆粒狀，難以鑒別菌落特性[5]，本研究的雙相培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入了顯色劑，實驗員可通過肉眼觀察雙相培養(yǎng)基變色情況判斷是否有分枝桿菌生長。

本研究顯示雙相培養(yǎng)基的敏感度為91.39%，特異度為94.98%。據(jù)文獻報道[16-20]，雙相培養(yǎng)基、加入不同營養(yǎng)物的固體培養(yǎng)基、各類液體培養(yǎng)基的敏感度在67.3%～98.3%、特異度在84.4%～100%，本研究結(jié)果在文獻報道范圍內(nèi)，且敏感度、特異度較高。雙相培養(yǎng)基與羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果的一致率為94.27%，假陰性率為8.61%，假陽性率為5.02%。在雙相培養(yǎng)基檢測出現(xiàn)假陰性的39例患者中，有24例涂片結(jié)果為陰性，8例涂片結(jié)果為1～8條/300個視野或+；有15例羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為實際菌落數(shù)，13例羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為+，由此得出盡管羅氏培養(yǎng)基檢出陽性，但陽性級別較低，而且多數(shù)是僅為其中1份痰標本檢出陽性，且涂片結(jié)果大多為陰性，因此雙相培養(yǎng)基沒能檢出也存在較大可能。出現(xiàn)假陽性的原因主要是雙相培養(yǎng)基診斷價值較高，檢出了羅氏培養(yǎng)基沒有檢出的一部分患者。出現(xiàn)假陽性的93例患者中，雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果均為實際菌落數(shù)，這說明雙相培養(yǎng)基在培養(yǎng)含菌量極低的痰標本時具有更高的陽性檢出率。盡管兩種培養(yǎng)基的ROC曲線下面積不是太高，主要因為比較對象是臨床診斷。結(jié)核病的臨床診斷主要依據(jù)臨床癥狀和體征，結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)、病理學(xué)、影像學(xué)等檢查的證據(jù)[21]。雖然細菌學(xué)診斷是結(jié)核病診斷的“金標準”，但痰涂片的陽性檢出率較低，痰培養(yǎng)雖可提高陽性檢出率，但也不足50%[22]。根據(jù)2018年全球結(jié)核病報告，我國2017年活動性肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率為32%[23]。《“十三五”全國結(jié)核病防治規(guī)劃》[24]中提出肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率需達到50%以上。本研究在活動性肺結(jié)核患者中，涂片陽性率為30.19%，涂片加羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率為43.11%，涂片加雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率為46.34%，使用雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率已經(jīng)更接近50%的目標，也提示需要采取結(jié)核分枝桿菌核酸檢測來進一步提高病原學(xué)陽性率。

雙相培養(yǎng)基較羅氏培養(yǎng)基報陽時間縮短10 d，略高于文獻報道的縮短6～9.3 d[10,25-27]。而且在不同陽性級別的痰標本中也表現(xiàn)出更短的報陽時間，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。隨著涂片陽性級別升高，雙相培養(yǎng)報陽時間隨之更短，報陽時間與標本中的活菌量有關(guān), 活菌量越大, 平均報陽時間越短[28]。本研究證實了這一結(jié)論。

雙相培養(yǎng)基較羅氏培養(yǎng)基具有更高的陽性檢出率，診斷價值較高，報陽時間明顯縮短，是一種可以作為結(jié)核病臨床診斷的參考方法，在我國基層實驗室有一定推廣應(yīng)用價值。

志謝湖南省邵陽市結(jié)核病防治醫(yī)院、廣西壯族自治區(qū)北海市結(jié)核病防治院、河南省南陽市第六人民醫(yī)院工作人員在研究現(xiàn)場所付出的努力與辛勤工作！