王藝璇，王芳，張涵，童芯鋅，陳璐，彭成，國錦琳

冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis為麥角菌科冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體。具有“補(bǔ)腎益肺，止咳化痰”之功效，長期以來被視為珍貴的補(bǔ)益類中藥。[1]中國是冬蟲夏草最主要的分布地，占全球冬蟲夏草分布面積的 90%以上[2]，由于全球氣候變暖和青藏高原生態(tài)環(huán)境的變化，冬蟲夏草的野生資源日趨減少，藥源緊缺[3]。近年來，不少學(xué)者致力于人工培養(yǎng)冬蟲夏草的研究[4-6]，但目前對于人工培養(yǎng)的冬蟲夏草與野生冬蟲夏草蛋白組差異的研究較少[7-9]。因此，本文對野生冬蟲夏草完全體、菌蟲復(fù)合體、子座及人工冬蟲夏草完全體、菌蟲復(fù)合體、子座的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，旨在從蛋白質(zhì)層面揭示野生冬蟲夏草與人工培育冬蟲夏草的差異，為后續(xù)科學(xué)評價人工冬蟲夏草奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

貝克曼X-22R型低溫高速離心機(jī)，Bio-Rad雙向電泳系統(tǒng)，Bio-Rad凝膠掃描成像系統(tǒng)，上海島韓實業(yè)公司DHG-9035A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 試劑

聚丙烯酰胺預(yù)混液、甘氨酸、BSA（純度≥99%）、Tris堿、CHAPS、碘乙酰胺、TEMED、SDS、尿素、過硫酸銨、覆蓋瓊脂糖、Quick Start?Bradford 1x Dye Reagent、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、IPG膠條（17 cm，pH3～10）、Bio-Lyte(pH3～10)、DTT、Precision Plus Protein? 預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)品、礦物油均購自Bio-Rad公司；PMS、APS、考馬斯亮藍(lán)R-250、低熔點瓊脂糖、溴酚藍(lán)、-巰基乙醇、Tween-80購自鵬程生物科技有限公司；水為超純水，甲醇、冰乙酸為分析純。

1.3 藥材

野生冬蟲夏草樣品 2017 年采自四川省阿壩州小金縣，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)國錦琳教授鑒定為正品野生冬蟲夏草，人工冬蟲夏草及小金蝠蛾幼蟲樣品由實驗室制備提供，留樣標(biāo)本存放于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室。

2 方法

2.1 蛋白質(zhì)提取

2.1.1 蛋白質(zhì)的提取[10-11]取樣品粉末約0.2 g，加入液氮適量，加入0. 02 mol·L-1PBS 緩沖液( pH7. 2)5 ml（1% PMSF），充分研磨至糊狀，4 ℃ 浸提過夜。取出離心，4 ℃，13000 r·min-1，30 min，重復(fù)離心，收集上清液。

2.1.2 蛋白質(zhì)的保存 將2.1.1得到的上清液用Bradford法[12]測定其含量，用0.22微米的膜除菌，無菌分裝于0.5 mL EP中，進(jìn)行標(biāo)記，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 蛋白質(zhì)含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備配制 BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mg·mL-1），按下表制作蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，用紫外分光光度計檢測OD595并記錄。

2.2.2 樣品含量測定 取2.1.1項下蛋白粗提液50 μL，采用2.2.1項進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定。

2.3 蛋白質(zhì)純化

2.3.1 TCA-丙酮沉淀蛋白[13]取2.1.1項下蛋白粗提取液，加入10倍體積TCA-丙酮（10%TCA，0.07%DTT），漩渦混合后于-20 ℃靜置1 h，離心，10 min，13000 r·min-1，棄去上清液；加入-20 ℃預(yù)冷丙酮洗滌4次，室溫自然干燥后水化上樣緩沖液溶解，低溫震搖1 h，離心取上清液，再次離心，取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 雙向電泳凝膠[13-15]

采用2.3.1項蛋白質(zhì)樣品，上樣量為600 μg。第一向不搭鹽橋的方式進(jìn)行水化，設(shè)置水化溫度20 ℃，被動水化12～16 h。第二向SDS-PAGE參照郭堯君[16]方法，凝膠濃度12%T，電泳過程起始采用低電流10 mA·gel-1，一小時后改變電流為30 mA·gel-1，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時停止電泳。

2.5 染色[17]

電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)法（0.1%考馬斯亮藍(lán)R250，45%甲醇，10%冰乙酸）染色，過夜，脫色液（10%甲醇，10%冰乙酸）搖床脫色至背景脫色干凈。

2.6 凝膠掃描及圖像分析

用Imagescaner II透射掃描儀對凝膠進(jìn)行掃描，分辨率為150dpi，保存圖像。使用PDQUESTTM Basic（Bio-Rad）和SPSS進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)的處理分析。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度（Y）對蛋白含量（X）進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y=1.1676X+0.016 （R2=0.9992）。結(jié)果表明，蛋白含量在0～1μg·μL-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.2 蛋白質(zhì)含量分析

表1 不同來源冬蟲夏草蛋白質(zhì)含量（n=3）

3.3 蛋白質(zhì)斑點數(shù)量分析

表2 不同來源冬蟲夏草蛋白斑點數(shù)（n=3）

3.4 差異蛋白斑點軟件分析

3.4.1 人工冬蟲夏草、野生冬蟲夏草差異蛋白分析 在野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草Ⅰ的對比分析中，僅存在與野生冬蟲夏草中的差異表達(dá)蛋白15個；僅存在與人工冬蟲夏草Ⅰ中的差異表達(dá)蛋白2個。在野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草Ⅱ的對比分析中，僅存在與野生冬蟲夏草中的差異表達(dá)蛋白25個；僅存在于人工冬蟲夏草Ⅱ中的差異表達(dá)蛋白2個，表達(dá)量明顯差異的蛋白3個。如圖1-4。

圖1 野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草Ⅰ差異表達(dá)蛋白

圖2 人工冬蟲夏草Ⅰ中存在的差異表達(dá)蛋白

圖3 野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草Ⅱ差異表達(dá)蛋白

圖4 人工冬蟲夏草Ⅱ中存在的差異表達(dá)蛋白及含量明顯減少的蛋白

3.4.2 人工冬蟲夏草、野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體差異蛋白分析 結(jié)果顯示，在野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體與人工冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體部分的對比分析中，僅存在于野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體中的差異表達(dá)的蛋白30個；僅存在于人工冬蟲夏草Ⅱ菌蟲復(fù)合體部分的差異蛋白4個。如圖5-6。

圖5 野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體存在的差異表達(dá)蛋白

圖6 人工冬蟲夏草Ⅱ菌蟲復(fù)合體部分存在的差異表達(dá)蛋白

3.4.3 人工冬蟲夏草子座、野生冬蟲夏草子座差異蛋白分析 結(jié)果顯示，在野生冬蟲夏草子座與人工冬蟲夏草Ⅱ子座部分的對比分析中，僅存在于野生冬蟲夏草子座中的差異表達(dá)蛋白4個；僅存在于人工冬蟲夏草Ⅱ子座部分的差異表達(dá)蛋白22個。如圖7-8。

圖7 野生冬蟲夏草子座存在的差異表達(dá)蛋白

圖8 人工冬蟲夏草Ⅱ子座部分存在的差異表達(dá)蛋白

4 討論

本研究通過2-DE分析技術(shù)，獲得了野生冬蟲夏草、人工冬蟲夏草及其菌蟲復(fù)合體、子座的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。圖譜分析發(fā)現(xiàn)野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草蛋白質(zhì)均具有良好的多樣性，蛋白質(zhì)種類豐富，在分子質(zhì)量10～90 kDa范圍內(nèi)普遍分布，多樣性良好。野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草蛋白質(zhì)斑點分布模式相似。

采用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量，分析發(fā)現(xiàn)野生冬蟲夏草蛋白質(zhì)含量為0.65%，人工冬蟲夏草蛋白質(zhì)含量為0.57%，野生冬蟲夏草子座蛋白質(zhì)含量為0.89%，人工冬蟲夏草子座蛋白質(zhì)含量為0.54%，野生品蛋白質(zhì)含量高于人工品，同時經(jīng)蛋白質(zhì)圖譜對比分析發(fā)現(xiàn)，野生冬蟲夏草及其菌蟲復(fù)合體、子座雖然與人工冬蟲夏草2-DE圖譜相似，具有相似的蛋白質(zhì)成分表達(dá)，野生冬蟲夏草蛋白質(zhì)斑點數(shù)為550，人工冬蟲夏草蛋白質(zhì)斑點數(shù)為364，野生冬蟲夏草子座蛋白質(zhì)斑點數(shù)為535，人工冬蟲夏草子座蛋白質(zhì)斑點數(shù)為300，在蛋白質(zhì)斑點數(shù)量上野生品遠(yuǎn)高于人工品，提示在冬蟲夏草菌侵染小金蝠蛾幼蟲的過程中，環(huán)境因子對冬蟲夏草內(nèi)在蛋白質(zhì)的表達(dá)具有正向的影響，基于蛋白質(zhì)層面揭示了野生冬蟲夏草在蛋白質(zhì)的含量與數(shù)量上優(yōu)于人工培育冬蟲夏草。為后續(xù)從蛋白質(zhì)水平上評價與鑒定人工冬蟲夏草奠定了基礎(chǔ)。