晏成倩，趙璐，王紅平，易恒，黃梅梅，黃明，曾南

家兔熱原檢查作為藥品質(zhì)量控制的一種重要手段，能直觀反映各種熱原對生物體的致熱特點(diǎn)和程度。影響家兔熱原檢查結(jié)果的因素很多，家兔的敏感性是其中一個(gè)很重要的因素。2015 年版 《中國藥典》四部通則中熱原檢查法不限定家兔的使用次數(shù)[1]，但對使用多次的家兔和休息后的高溫兔進(jìn)行靈敏度檢查，能提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，對規(guī)范熱原檢查具有非常重要的意義。因此通過以下實(shí)驗(yàn)探討細(xì)菌內(nèi)毒素多次給藥對家兔致熱靈敏度的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

新西蘭兔，普通級，雌雄兼有，體重2.1～3.5 kg，由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-14。飼養(yǎng)條件：溫度20 ℃～26 ℃，相對濕度40 %～70 %，12 / 12小時(shí)明暗交替照明。

1.2 試藥

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，中國藥品生物制品檢定研究院，規(guī)格：80 EU/支，批號：150601-201784）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：50 mL，批號：17033005）；氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：G117062804）

細(xì)菌內(nèi)毒素溶液配制：用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，于渦旋混合器上混勻15 min，然后使用氯化鈉注射液進(jìn)行稀釋，最終稀釋至2個(gè)濃度1 EU﹒mL-1、0.5 EU﹒mL-1、0.25 EU﹒mL-1。

1.3 儀器

ZRY-2D型智能熱原儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；MS3 型旋渦混和器( 德國 IKA 公司)；OMH 180 SS 型高溫烘箱( Thermo Scientific Heratherm)；試驗(yàn)所用器皿均經(jīng)250 ℃烘烤2 h去除外源性細(xì)菌內(nèi)毒素。

2 實(shí)驗(yàn)方法

按照 2015 年版 《中國藥典》 四部通則熱原檢查法規(guī)定進(jìn)行新兔挑選。熱原檢查前進(jìn)行基礎(chǔ)體溫測定，取符合熱原檢查法規(guī)定的家兔36只，隨機(jī)分成3個(gè)組，每組12只。分別給予10 EU﹒kg-1、5 EU﹒kg-1、2.5 EU﹒kg-1的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量，每組注射體積均為10 mL﹒kg-1。每組家兔共注射4次細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每次間隔17 d。給藥后每隔30分鐘測量一次體溫，共測量6次。若第2、3、4次熱原檢查前進(jìn)行基礎(chǔ)體溫測定時(shí)，有家兔不符合規(guī)定則將其淘汰。記錄每組家兔每次給藥的動(dòng)物數(shù)，計(jì)算平均最大升溫值（降溫均以0℃計(jì)）、升溫率（最大升溫≥0.6 ℃的動(dòng)物數(shù)/動(dòng)物數(shù)）和入選率（入選動(dòng)物數(shù)/動(dòng)物數(shù)）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，每次給藥后，家兔在1.5 h左右升溫可達(dá)到最大值，各組升溫幅度隨細(xì)菌內(nèi)毒素劑量的增加而增大，組間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或0.01），其中5 EU﹒kg-1和10 EU﹒kg-1的平均升溫均超過0.6 ℃，升溫率超過60 %，熱原反應(yīng)呈陽性結(jié)果，而隨著給藥次數(shù)的增加，同一劑量組的平均升溫未產(chǎn)生明顯變化，而家兔入選數(shù)則減少。同時(shí)家兔入選率還與細(xì)菌內(nèi)毒素劑量呈明顯相關(guān)性，劑量越大，入選率越低，其中以10 EU﹒kg-1表現(xiàn)尤為顯著，從最初12只到第2次給藥9只，再到第3次給藥8只，最后第4次給藥僅4只。另外，詳見表1、表2和圖1、圖2。

表1 各組家兔注射細(xì)菌內(nèi)毒素后體溫平均升溫值及升溫率

表2 各組家兔注射細(xì)菌內(nèi)毒素的入選動(dòng)物數(shù)及入選率

圖1 不同劑量的細(xì)菌內(nèi)毒素致家兔體溫升高情況圖

圖2 各劑量組家兔入選數(shù)量變化圖

4 討論

《中國藥典分析檢測技術(shù)指南》建議采用5 EU﹒kg-1（或10 EU﹒kg-1）內(nèi)毒素劑量按熱原檢查法對家兔進(jìn)行靈敏度考核驗(yàn)證，故本實(shí)驗(yàn)選擇2.5 EU﹒kg-1、5 EU﹒kg-1和10 EU﹒kg-1的細(xì)菌內(nèi)毒素作為多次給藥的劑量。另外藥典規(guī)定升溫達(dá)0.6 ℃的家兔應(yīng)休息2周以上，考慮到家兔體重增長和藥典規(guī)定3周內(nèi)未曾使用的家兔應(yīng)在檢查供試品前7日內(nèi)進(jìn)行預(yù)測體溫，所以每次間隔17 d給藥。

從首次給藥看，家兔最低靈敏度可達(dá)到5 EU﹒kg-1，注射劑人每千克體重每小時(shí)最大可接受細(xì)菌內(nèi)毒素劑量為5 EU﹒(kg﹒h)-1，所以在考察家兔靈敏度時(shí)，應(yīng)把5 EU﹒kg-1作為最低檢測限。另外，因?yàn)?0 EU﹒kg-1劑量能致家兔接近100 %發(fā)熱，更適合在注射劑進(jìn)行適用性考察時(shí)使用。

文獻(xiàn)報(bào)道，家兔短期內(nèi)多次接觸細(xì)菌內(nèi)毒素劑量可產(chǎn)生耐受性，降低其對熱原物質(zhì)的靈敏度，造成假陰性結(jié)果[3～6]。同時(shí)藥典規(guī)定供試品判定為不符合規(guī)定，則組內(nèi)全部家兔不再使用。但在本實(shí)驗(yàn)中各劑量組家兔每次給藥后平均升溫值變化不大，表明注射細(xì)菌內(nèi)毒素溶液的家兔休息17 d后其對熱原物質(zhì)的靈敏度不會(huì)降低，可繼續(xù)用于熱原檢查。所以升溫家兔休息后再利用是可行的，這有利于提高熱原檢查家兔的利用率，亦符合3R原則。

另外，從每次給藥家兔只數(shù)看，劑量越大的組，熱原檢查前基礎(chǔ)體溫符合規(guī)定家兔數(shù)越少，所以對休息后升溫家兔進(jìn)行重新選兔后再使用很有必要。同時(shí)家兔接受低于閾劑量的細(xì)菌內(nèi)毒素后，休息兩周以上時(shí)，其對細(xì)菌內(nèi)毒素靈敏度升高，這對熱原檢查的影響需更進(jìn)一步研究。