杜春華，張曉南，游燕*，李東嫻，王鵬，曹紅云

藥品微生物限度是藥品安全性的重要指標(biāo)之一。在中藥制劑處方中，有些藥材自身對微生物細(xì)胞有一定抑制作用。不同中藥制劑的抑菌成分與作用強(qiáng)弱不同，供試品中的微生物在抑菌成分存在下可能檢不出，為了消除其對微生物的影響，需對每種樣品建立適宜的微生物限度檢查法[1]。金銀花具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效。用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫病發(fā)熱[2]。市面上銷售的很多中成藥都含有金銀花成分[3～4]，本研究選取3種含金銀花的中成藥雙黃連口服液、金銀花復(fù)方顆粒、金銀花露，依據(jù)2015年版《中國藥典》四部中通則1105、1106對3種制劑的微生物限度與控制菌的檢查方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，為含該類中藥材的藥品制定微生物檢查提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號：G S P-9160MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），生化培養(yǎng)箱（型號：LRH-150，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），二級生物安全柜（型號：BSC-1100ⅡB2-X，濟(jì)南鑫貝西）

1.2 試藥

1.2.1 供試品 雙黃連口服液：（批號：170213012、170104032、170105032），金銀花復(fù)方顆粒：（批號：7274507、7274404、7274502），金銀花露：（批號：170404、170405、170406）

1.2.2 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號170310；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號1706282；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號170608；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號3106032；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，批號160303；麥康凱瓊液體培養(yǎng)基，批號161228；pH 7.0無菌氯化鈉 -蛋白胨緩沖液，批號1705184。（以上培養(yǎng)基除沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基來源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司其余培養(yǎng)基均來源于北京三藥科技開發(fā)公司。）

1.3 試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]銅綠假單胞[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003],均來源于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

按《中國藥典》2015版四部通則1105、1106、1107要求，確定口服給藥項(xiàng)下的固體制劑和液體制劑（不含藥材原粉的中藥制劑）需檢查需氧菌總數(shù)，霉菌和酵母菌總數(shù)，控制菌檢查大腸埃希菌。

2.1 菌液制備

2.1.1 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞、枯草芽孢桿菌的制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，然后將各菌種分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)不大于100cfu的菌懸液。

2.1.2 白色念珠菌、黑曲霉的制備 接種白色念珠菌、黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，置20～25 ℃分別培養(yǎng)2～3天和5～7天，然后將各菌種分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)不大于100 cfu的菌懸液。

2.2 供試液制備

固體制劑取供試品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml中溶解，混勻，作為1:10的供試液。液體制劑取供試品10 ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 ml中溶解，混勻，作為1:10的供試液。

3 微生物限度方法驗(yàn)證

3.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

試驗(yàn)組:取1:10供試液9.9 ml于滅菌試管中，加入制備好的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1 ml，使其終濃度為每1 ml含菌落數(shù)不大于100 cfu的菌液，從試管中吸取1 ml注入滅菌平皿中，立刻傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30～35℃培養(yǎng)48 h。每個(gè)菌種平行制備2個(gè)平皿，測定試驗(yàn)組的菌落數(shù)。

供試品對照組:取1:10供試液9.9 ml于滅菌試管中，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 ml，其余按試驗(yàn)組操作，測定供試品對照組的菌落數(shù)。

菌液對照組:取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 ml于滅菌試管中，加入制備好的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1 ml，使其終濃度為每1 ml不大于100 cfu的菌液，其余按試驗(yàn)組操作，測定菌液對照組的菌落數(shù)。

陰性對照組:取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液1ml，加入霉菌平皿中，其余按試驗(yàn)組操作，平行做兩個(gè)皿。

按[回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組平均菌落數(shù)]計(jì)算回收率，結(jié)果見表1、表2、表3。

表1 雙黃連口服液需氧菌總數(shù)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

表2 金銀花復(fù)方顆粒需氧菌總數(shù)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

表3 金銀花露需氧菌總數(shù)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

由表1、表2、表3得出，5株需氧菌的回收比值均在0.5 ～ 2 之間，符合藥典規(guī)定，因此可照此常規(guī)法進(jìn)行雙黃連口服液、金銀花復(fù)方顆粒、金銀花露的需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)。

3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

取1:10供試液9.9 ml于滅菌試管中，加入制備好的白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1 ml，使其終濃度為每1 ml含菌落數(shù)不大于100 cfu的菌液，從試管中吸取1 ml注入滅菌平皿中，立刻傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中20～25 ℃培養(yǎng)72 h。每個(gè)菌種平行制備2個(gè)平皿，測定試驗(yàn)組的菌落數(shù)。同法測定供試品對照組、菌液對照組和陰性對照組的菌落數(shù)。按[回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組平均菌落數(shù)]計(jì)算回收率，結(jié)果見表4、表5、表6。

表4 雙黃連口服液霉菌和酵母菌總數(shù)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

表5 金銀花復(fù)方顆粒霉菌和酵母菌總數(shù)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

表6 金銀花露霉菌和酵母菌總數(shù)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

由表4、表5、表6得出，2株真菌的回收比值均在0.5 ～ 2 之間，符合藥典規(guī)定，因此可照常規(guī)法進(jìn)行雙黃連口服液、金銀花復(fù)方顆粒、金銀花露的霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。

3.3 控制菌檢查方法適用性驗(yàn)證

3.3.1 常規(guī)法檢查大腸埃希菌

試驗(yàn)組

取1:10供試液10 ml及制備好的大腸埃希菌菌懸液1 ml加入到100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24小時(shí)后吸取1 ml培養(yǎng)物接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)24小時(shí)。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察是否有菌落生長。

陽性對照組

取制備好的大腸埃希菌菌懸液1 ml加入到100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時(shí)。其他操作同試驗(yàn)組。

陰性對照組

取10 mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液加入到100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時(shí)。其他操作同試驗(yàn)組。

供試品對照組

取1:10供試液10 ml加入到100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時(shí)。其他操作同試驗(yàn)組。

表7 大腸埃希菌檢查方法(胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基：100ml)驗(yàn)證結(jié)果

由表7得出，3個(gè)制劑的試驗(yàn)組和陽性對照組檢出大腸埃希菌，陰性對照試驗(yàn)組無菌生長，3個(gè)制劑的大腸埃希菌可用常規(guī)法進(jìn)行檢查。

4 討論

中藥制劑含有多種成分的復(fù)合制劑，其中任何成分具有均可影響微生物限度檢查的準(zhǔn)確性，因此同其他分析方法一樣，藥品微生物限度檢查也應(yīng)證明所采用的方法是適宜的，才能保證檢查方法的完整性和準(zhǔn)確性[5]。依據(jù)2015年版《中國藥典》的規(guī)定，為了確認(rèn)所采用的方法適合用于某制劑的微生物限度檢查，必須對相應(yīng)檢驗(yàn)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。本次實(shí)驗(yàn)中所選用的雙黃連口服液、金銀花復(fù)方顆粒、金銀花露制劑都進(jìn)行了微生物限度方法的建立并進(jìn)行了驗(yàn)證，確立了檢查方法有效。雖然文獻(xiàn)上[6～8]有記載金銀花內(nèi)的綠原酸成分，具有極強(qiáng)的抗菌、抗病毒功能，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)含有金銀花的制劑對藥典規(guī)定驗(yàn)證用5種試驗(yàn)菌株（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉）的抑菌活性較小，均可采用常規(guī)法。對3個(gè)含有金銀花的中藥制劑控制菌檢查方法有效性驗(yàn)證結(jié)果表明，3個(gè)制劑的控制菌均可使用常規(guī)法進(jìn)行檢查。