魏譚軍，胡鳳嬌，王張，肖成，宋文杰，周殿儒，孫位軍，王毅

理氣散結(jié)浸膏，由柴胡、香附、延胡索、甘草、青皮、蜂房、山慈菇、川芎、當歸、白芍等組成，具有理氣調(diào)血、散結(jié)止痛的功效，主治肝郁血瘀，乳腺增生，乳癖結(jié)塊，乳癰初起，乳房脹痛。此劑型為理氣散結(jié)丸的改良劑型，原劑型是達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院臨床使用20余年的醫(yī)療機構(gòu)制劑，系藥材直接打粉后制成的大蜜丸，存在服用劑量大、口感差、運輸攜帶保存不便、起效緩慢、患者依從性不好、原粉入藥微生物易超標等缺點，不僅給患者帶來不便，也限制了該藥的推廣。此次改良劑型，可以更優(yōu)化的保存藥效、穩(wěn)定質(zhì)量、減小服用量，便于臨床應用，擴大市場規(guī)模，受眾更廣。

根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局制定的《醫(yī)療機構(gòu)制劑注冊管理辦法》（試行，局令第20號，2005年[4]；征求意見稿， 2015年[5]）和四川省食品藥品監(jiān)督管理局制定的《四川省醫(yī)療機構(gòu)制劑研究技術(shù)指南（試行版）》（2014年）[6]，理氣散結(jié)顆粒擬申請四川省醫(yī)療機構(gòu)中藥制劑批文，因該處方組成含有法定標準中標識有毒性或現(xiàn)代毒理學證明有毒性的藥材，如山慈菇和蜂房[7]，故需開展急性毒性實驗研究，可為長期毒性試驗和主要藥效學研究中的劑量設(shè)置提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物

理氣散結(jié)浸膏，生產(chǎn)批號為151125，由達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院生產(chǎn)。按照理氣散結(jié)顆粒的最大給藥濃度和最大給藥體積分別給予小鼠和大鼠后，給藥劑量較低，不足以充分暴露其毒性，故改用理氣散結(jié)浸膏（僅未添加制備成顆粒的輔料糖粉和糊精），盡可能的以實驗可操作的最大濃度開展急性毒性實驗。

生理鹽水：規(guī)格為500 mL:4.5 g，批號為C151136，由昆明南疆制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗動物

SPF級KM種小鼠和SD大鼠各40只，全雌，體重為20±2 g、200±20 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2015-030，《四川省實驗動物質(zhì)量合格證》號：№51203500000542。

動物實驗設(shè)施、場地由成都中醫(yī)藥大學提供。

1.3 試劑

血常規(guī)試劑：溶血劑（批號1608014）、稀釋劑（批號1607022）、清洗劑（批號1608018）。

血液生化學試劑：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（批號1612118）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（批號1611104）、堿性磷酸酶（批號1603110）、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（批號1605132）、總膽紅素（批號1603111）、總蛋白（批號1611109）、白蛋白（批號1604101）、尿素氮（批號1604212）、肌酐（批號1609114）、膽固醇（批號1610110）、甘油三脂（批號1612101）、葡萄糖（批號1603114）、肌酸激酶（批號1605135）。

血常規(guī)試劑和血液生化學試劑均購自上海特康科技有限公司。

1.4 儀器

全自動生化分析儀，型號TC6010L，產(chǎn)自上海特康科技有限公司；全自動三分群血液分析儀，型號TEK-Ⅱ MINI，產(chǎn)自上海特康科技有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 預實驗 小鼠和大鼠分別按最大給藥容積40和20 mL﹒kg-1給予最大濃度2.4365 g原生藥材/mL的理氣散結(jié)浸膏溶液后，動物仍未出現(xiàn)死亡，故給予理氣散結(jié)浸膏原液無法測出LD50。因此，按《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導原則》的要求，依據(jù)“動物能耐受的最大給藥容積、最大給藥濃度的藥量單次或24 h內(nèi)多次（2～3次）給藥”的規(guī)定，采用最大給藥量法評價理氣散結(jié)浸膏的急性毒性[3]。

1.5.2 動物分組 將實驗小鼠和大鼠按體重分層，隨機分為空白對照組和理氣散結(jié)浸膏組，每組20只，試驗前禁食16小時，但不禁水。

1.5.3 給藥方法 經(jīng)預試結(jié)果可知，理氣散結(jié)浸膏組小鼠可按照最大容積(40 mL﹒kg-1)、最大給藥濃度2.4365 g生藥/mL一次性灌胃給藥，即給藥劑量為97.46 g生藥/（kg.d）；理氣散結(jié)浸膏組大鼠可按照最大容積(20 mL﹒kg-1)、最大給藥濃度2.4365 g生藥/mL分兩次灌胃給藥，每次間隔4 h，即給藥劑量為48.73 g生藥/（kg﹒d）?？瞻讓φ战M均給予最大容積的生理鹽水。給藥后1 h內(nèi)，觀察并記錄動物是否出現(xiàn)中毒反應以及中毒反應的出現(xiàn)時間、維持時間、是否可逆及嚴重程度，分析可能的靶器官、組織或系統(tǒng)。后每天觀察1次，連續(xù)觀察14天。

1.5.4 觀察指標

1.5.4.1 一般狀況觀察 觀察并記錄各組每只動物有無異常，注意有無顫抖、震顫、抽搐、流涎、腹瀉、少動、精神萎靡不振、昏迷等毒性反應癥狀。同時觀察中毒反應的出現(xiàn)時間、維持時間、是否可逆及嚴重程度，分析可能的靶器官、組織或系統(tǒng)。

1.5.4.2 體重和飼料消耗量 在給藥前1天、給藥當天、給藥后第7天和第14天時，觀察和記錄各組動物的體重(g)變化及進食（飼料消耗量，g/(kg﹒d)）情況。

1.5.4.3 血常規(guī)和血液生化學檢測 在給藥后第14天時，觀察未死亡動物的一般情況、天然孔道情況，然后小鼠摘眼球取血，其中每組的10只小鼠取0.5～1 mL抗凝處理，另10只小鼠取0.5～1 mL凝固后分離血清0.3～0.5 mL；大鼠以3 mL﹒kg-1腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，其中取0.5～1 mL抗凝處理，另取0.5～1 mL凝固后分離血清0.3～0.5 mL，檢測相應血常規(guī)和血液生化學指標。

1.6 統(tǒng)計學應用

運用SPSS 19.0計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±S）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況和尸檢結(jié)果

灌胃30 min～1 h內(nèi)，小鼠和大鼠均出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩、鼻尖微微發(fā)紅的癥狀，但很快恢復正常，觀察期內(nèi)，無動物死亡。尸檢，臟器均未出現(xiàn)肉眼可見病變。

2.2 體重及飼料消耗量

2.2.1 小鼠 與給藥前一天比較，給藥后第1、7、14天，各組小鼠的體重及飼料消耗量均存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）；與空白對照組比較，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表1、表2。

表1 小鼠體重的變化情況(g, ±S)

表1 小鼠體重的變化情況(g, ±S)

注：與給藥前1天比較，# P＜0.05，## P＜0.01;與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對照組（n=20） —— 23.06±1.10 23.84±1.20# 26.20±1.53## 27.88±1.55##理氣散結(jié)浸膏組（n=20） 97.46 23.40±0.86 24.37±0.90## 25.55±2.83## 27.56±1.78##

表2 小鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

表2 小鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

注：同上

組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對照組 —— 216.06±7.64 169.54±36.97 157.78±10.14## 157.93±8.53##理氣散結(jié)浸膏組 97.46 222.10±11.83 145.82±21.99## 177.16±23.44# 152.74±8.12##

2.2.2 大鼠 與給藥前一天比較，給藥后第1天，大鼠的飼料消耗量顯著降低（P＜0.05），給藥后第7、14天，各組大鼠體重有十分顯著地差異（P＜0.01）；與空白對照組比較，給藥后第1天，大鼠的飼料消耗量顯著降低（P＜0.05），詳見表3、表4。

表3 大鼠體重的變化情況(g, ±S)

表3 大鼠體重的變化情況(g, ±S)

注：同上

組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對照組（n=20） —— 215.77±6.41 216.07±5.12 233.16±8.74## 246.96±8.67##理氣散結(jié)浸膏組（n=20） 48.73 212.44±5.02 213.91±5.17 228.54±9.18## 242.70±12.89##

表4 大鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

表4 大鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

注：同上

組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對照組 —— 74.66±9.06 72.29±6.09 83.57±4.37 77.49±4.13理氣散結(jié)浸膏組 48.73 75.93±9.92 51.76±5.53#** 83.75±3.16 74.17±2.65

2.3 血常規(guī)

2.3.1 小鼠 與空白對照組比較，理氣散結(jié)浸膏經(jīng)口一次性灌胃給予小鼠后14天，動物血紅蛋白（HGB）、紅細胞比積（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）和平均血小板體積（MPV）差異顯著（P＜0.05），但其變化均在正常范圍內(nèi)；其余各項血常規(guī)指標均無顯著性差異（P＞0.05），詳見表5、表6。

表5 小鼠的血常規(guī)測定結(jié)果(±S)

表5 小鼠的血常規(guī)測定結(jié)果(±S)

注：與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

血紅蛋白含量g﹒L-1指標 名稱 紅細胞數(shù)×1012/L紅細胞比積L/L平均紅細胞體積Fl平均血紅蛋白含量Pg平均血紅蛋白濃度g﹒L-1空白對照組 n=10 5.59±0.48 117.90±10.08 0.25±0.02 45.43±1.42 20.01±0.98 463.50±16.03理氣散結(jié)浸膏組 n=10 5.27±0.37 109.60±5.87* 0.23±0.02* 44.26±0.66* 19.70±0.61 468.70±14.32續(xù)表5中間細胞絕對值109/L空白對照組 n=10 18.30±0.39 60.77±33.72 350.60±121.13 7.11±0.14 6.09±1.58 3.80±0.88 0.44±0.10理氣散結(jié)浸膏組 n=10 18.47±0.38 76.68±14.83 390.10±77.86 6.95±0.10** 5.39±0.87 3.41±0.58 0.44±0.07指標 名稱 紅細胞寬度變異系數(shù)%紅細胞寬度標準差fL血小板數(shù)109/L平均血小板體積fL白細胞數(shù)109/L淋巴細胞絕對值109/L續(xù)表5血小板分布寬度%空白對照組 n=10 1.84±0.67 63.09±4.30 7.11±0.71 29.80±4.69 0.25±0.08 15.02±3.15理氣散結(jié)浸膏組 n=10 1.56±0.35 63.48±3.89 7.65±0.50 28.87±3.92 0.27±0.06 13.34±2.40指標 名稱 粒細胞絕對值109/L淋巴細胞百分比%中間細胞百分比%粒細胞百分比%血小板比積%

2.3.2 大鼠 與空白對照組比較，理氣散結(jié)浸膏經(jīng)口分兩次灌胃給予大鼠后14天，各項血常規(guī)指標均無顯著性差異（P＞0.05），詳見表6。

表6 大鼠的血常規(guī)測定結(jié)果(±S)

表6 大鼠的血常規(guī)測定結(jié)果(±S)

注：與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

血紅蛋白含量g﹒L-1指標 名稱 紅細胞數(shù)1012/L紅細胞比積L/L平均紅細胞體積Fl平均血紅蛋白含量Pg平均血紅蛋白濃度g﹒L-1空白對照組 n=20 5.04±0.28 123.65±4.28 0.24±0.01 48.03±0.86 23.25±0.90 509.55±14.08理氣散結(jié)浸膏組 n=19 5.03±0.33 124.21±4.18 0.24±0.01 48.27±1.50 23.47±1.27 511.58±22.29續(xù)表6淋巴細胞絕對值109/L空白對照組 n=20 17.75±0.35 49.62±12.10 335.45±108.00 7.34±0.10 12.44±2.09 7.98±0.96理氣散結(jié)浸膏組 n=19 17.98±0.46 50.55±13.72 322.95±130.56 7.36±0.14 11.96±2.07 7.59±1.77指標 名稱 紅細胞寬度變異系數(shù)%紅細胞寬度標準差fL血小板數(shù)109/L平均血小板體積fL白細胞數(shù)109/L續(xù)表6血小板分布寬度%空白對照組 n=20 0.86±0.15 3.52±1.42 64.94±7.65 7.02±0.54 29.55±11.06 0.25±0.08 19.07±1.51理氣散結(jié)浸膏組 n=19 0.87±0.19 3.50±1.02 63.11±7.88 7.22±0.92 29.67±8.63 0.24±0.10 19.94±2.00指標 名稱 中間細胞絕對值109/L粒細胞絕對值109/L淋巴細胞百分比%中間細胞百分比%粒細胞百分比%血小板比積L﹒L-1

2.4 血液生化學

2.4.1 小鼠 與空白對照組比較，理氣散結(jié)浸膏經(jīng)口一次性灌胃給予小鼠后14天，動物血清中膽固醇（TC）含量顯著降低（P＜0.05），但其變化值在正常范圍內(nèi)；其余各項血液生化學指標均無顯著性差異（P＞0.05），詳見表7。

表7 小鼠的血液生化學指標測定結(jié)果(±S)

表7 小鼠的血液生化學指標測定結(jié)果(±S)

注：與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

甘油三酯mmol﹒L-1空白對照組 n=10 82.50±10.51 157.10±27.87 8.62±1.43 1.45±0.13 0.83±0.08理氣散結(jié)浸膏組 n=10 81.40±11.38 150.40±18.23 7.46±1.50 1.24±0.13** 0.84±0.10指標 名稱 谷丙轉(zhuǎn)氨酶u﹒L-1谷草轉(zhuǎn)氨酶u﹒L-1總紅膽素umol﹒L-1膽固醇mmol﹒L-1續(xù)表7葡萄糖mmol﹒L-1空白對照組 n=10 73.87±3.81 23.61±1.53 50.26±4.70 0.48±0.06 6.74±0.73理氣散結(jié)浸膏組 n=10 73.04±3.34 23.12±2.91 49.92±2.27 0.46±0.07 6.60±0.75指標 名稱 總蛋白g﹒L-1白蛋白g﹒L-1球蛋白g﹒L-1白球比——

2.4.2 大鼠 與空白對照組比較，理氣散結(jié)浸膏經(jīng)口分兩次灌胃給予大鼠后14天，動物血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和葡萄糖（GLU）差異顯著（P＜0.05），但變化均在正常范圍內(nèi)；其余各項血液生化學指標均無顯著性差異（P＞0.05），詳見表8。

表8 大鼠的血液生化學指標測定結(jié)果(±S)

表8 大鼠的血液生化學指標測定結(jié)果(±S)

注：與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

谷草轉(zhuǎn)氨酶u﹒L-1指標 名稱 谷丙轉(zhuǎn)氨酶u﹒L-1堿性磷酸酶u﹒L-1谷氨酰轉(zhuǎn)移酶u﹒L-1總紅膽素umol﹒L-1總蛋白g﹒L-1白蛋白g﹒L-1空白對照組 n=20 56.50±8.29 132.45±25.76 170.30±54.81 11.50±2.86 6.69±2.99 60.63±8.53 24.44±1.33理氣散結(jié)浸膏組 n=19 44.84±7.41** 149.21±22.55* 139.89±49.41 10.37±3.32 7.62±3.34 62.75±7.94 24.01±1.60續(xù)表8白球比——指標 名稱 球蛋白g﹒L-1尿素氮mmol﹒L-1肌酐umol﹒L-1膽固醇mmol﹒L-1甘油三酯mmol﹒L-1肌酸激酶u﹒L-1葡萄糖mmol﹒L-1空白對照組 n=20 36.19±8.76 0.72±0.21 5.10±2.16 83.40±27.18 1.26±0.33 0.64±0.24 145.75±49.62 8.75±2.73理氣散結(jié)浸膏組 n=19 38.74±8.27 0.65±0.15 6.39±1.93 84.11±18.35 1.28±0.29 0.80±0.41 178.58±76.06 7.18±1.47*

3 討論

本次急性毒性實驗小鼠和大鼠經(jīng)口灌胃給予理氣散結(jié)浸膏的最大劑量分別為97.46 g生藥/（kg﹒d）和48.73 g生藥/（kg﹒d），相當于成人臨床日用劑量0.3914 g生藥/（kg﹒d）的249倍和124倍，根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導原則》進行MTD法的測定，采用小鼠最大耐受藥量倍數(shù)計算，以耐受人臨床用量的100倍以上為安全[2]。且實驗結(jié)果表明，在此劑量下給藥后，均未見動物死亡、中毒癥狀、臟器、體重和飼料消耗量等異常變化，血常規(guī)和血液生化學指標的變化也都在正常范圍內(nèi)，說明組方中山慈菇和蜂房在經(jīng)過炮制加工之后，其毒性降低到了較為安全的范圍。綜上可得，理氣散結(jié)浸膏整體毒性較低，無明顯急性毒性。本結(jié)果可為長期毒性試驗和主要藥效學研究中的劑量設(shè)置提供依據(jù)。