劉巧，李奇娟，謝余，高玉蓮，王戰(zhàn)軍，胡慧玲，王戰(zhàn)國(guó)

三黃瀉心湯始載于張仲景的《金匱要略》，由大黃、黃連、黃芩三味中藥組成，用于治療“心氣不足，吐血釁血”血熱證的代表方劑，具瀉火解毒，清熱燥濕等功效[1～3]。膽汁酸在消化中調(diào)節(jié)腸道微生物群，調(diào)節(jié)膽固醇、脂質(zhì)和葡萄糖體內(nèi)平衡所必需的途徑中起重要作用[4]。膽汁酸代謝反映了腸道菌群的代謝穩(wěn)定性，反映了肝-腸循環(huán)的藥物代謝過(guò)程[5～6]。研究表明，大黃中大黃素可通過(guò)降低總膽汁酸來(lái)治療膽汁淤積[7～9]，而對(duì)于三黃瀉心湯及其有效組分對(duì)于總膽汁酸的代謝影響尚未明確報(bào)道。因此，本課題對(duì)瀉心湯及其有效成分不同配伍組分對(duì)大鼠在24 h內(nèi)的總膽汁酸代謝影響進(jìn)行了研究，以期找出藥物對(duì)大鼠血清總膽汁酸（Total bile acid, TBA）分泌的影響，為后期的病理模型研究和臨床上膽汁酸代謝性疾病的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 試藥

大黃素（長(zhǎng)沙中仁生物科技有限公司，批號(hào)：161022，純度＞98%），鹽酸小檗堿（長(zhǎng)沙中仁生物科技有限公司，批號(hào)：161102 ，純度＞97%），黃芩苷（長(zhǎng)沙中仁生物科技有限公司，批號(hào)：161105，純度＞95%）；大黃藥材（四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)：161010），黃連藥材（四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)：170330），黃芩藥材（四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)：160827），經(jīng)鑒定，藥材各項(xiàng)指標(biāo)均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定項(xiàng)下要求。大鼠血清總膽汁酸（TBA）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海盈公實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：20170708）。

1.2 儀器

TGL-16C型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BT125D電子天平（德國(guó)賽多利斯）；352型酶標(biāo)儀（Labsystems Multiskan MS）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 TBA測(cè)定原理

TBA試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠總膽汁酸（TBA）水平。用純化的大鼠總膽汁酸（TBA）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入總膽汁酸（TBA），再與HRP標(biāo)記的總膽汁酸（TBA）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的總膽汁酸（TBA）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠總膽汁酸（TBA）濃度。

2.2 樣品溶液的制備

所有分組灌胃給藥體積為4 mL/只，按2015年版《中國(guó)藥典》[1]中三黃片量擴(kuò)大10倍計(jì)算。灌胃溶液的具體配制方法如下：

2.2.1 大黃素灌胃液的配制

取大黃素40 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用2.5 mL乙醇溶解（超聲溶解）后，加生理鹽水稀釋至刻度線，即得濃度約為0.8 mg﹒mL-1的大黃素灌胃溶液。

2.2.2 大黃素+鹽酸小檗堿配比灌胃液的配制 取大黃素40 mg、鹽酸小檗堿120 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用2.5 mL乙醇溶解（超聲溶解）后，加生理鹽水稀釋至刻度線，即得。

2.2.3 大黃素+鹽酸小檗堿+鹽黃芩苷配比灌胃液的配制 取大黃素40 mg、鹽酸小檗堿120 mg、黃芩苷360 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用2.5 mL乙醇溶解（超聲溶解）后，加生理鹽水稀釋至刻度線，即得。

2.2.4 三黃瀉心湯合煎液的制備 取大黃粉末60 g、黃連粉末30 g、黃芩粉末30 g（過(guò)四號(hào)篩），精密稱定，以上三味，加入10倍量純水浸泡30 min后煎煮三次，第一次1.5 h，第二次1 h，第三次40 min，合并煎液，趁熱濾過(guò)，即得煎煮液約400 mL。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥劑量

30只雄性SD大鼠，體重250 g左右，隨機(jī)分為A、B、C、D、control五組，每組6只，A組：大黃素+鹽酸小檗堿+黃芩苷配比組； B組：大黃素+鹽酸小檗堿配伍組；C組：大黃素組；D組：三黃瀉心湯組；Control組：空白生理鹽水組。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)飼養(yǎng)一周，給予標(biāo)準(zhǔn)光照周期（14 h光照、10 h黑夜），實(shí)驗(yàn)室溫度維持在20～25 ℃，相對(duì)濕度控制在70 %左右。實(shí)驗(yàn)前給予自由飲水并禁食12 h，試驗(yàn)當(dāng)天早晨稱重，按預(yù)定劑量給藥4 mL/只。

2.4 大鼠血清的收集及測(cè)定方法

實(shí)驗(yàn)前，先收集空白血清0.5 mL，然后分別灌胃給予各組設(shè)計(jì)給藥劑量，隨后于灌胃后15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h采用大鼠斷尾取血法收集血液0.5 mL，室溫靜置30 min后，以12000 r﹒min-1離心10 min，取上層血清，于-80 ℃ 凍存，備用。

按照TBA試劑盒說(shuō)明書的操作說(shuō)明，首先分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μL，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加待測(cè)樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。然后將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。隨后用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。隨后小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液（將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后用），靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。隨后每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃ 溫育30 min。洗滌5次。然后每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃ 避光顯色10 min。最后，每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），測(cè)定在15 min以內(nèi)完成。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用（ S）表示，計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，正態(tài)分布資料采用單因素方差分析，非正態(tài)分布資料先轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布再用單因素方差分析。進(jìn)行組間比較，P＜0.05為數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)有顯著性差異。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密吸取試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成相應(yīng)濃度（20、10、5、2.5、1.25、0 μmoL﹒L-1），按“2.4 大鼠血清的收集及測(cè)定方法”測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。線性方程為：y=11.8721x-0.2815，r=0.9987，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品在0～20 μmoL﹒L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，可用于后期血清樣品中TBA的檢測(cè)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 三黃瀉心湯及其有效組分對(duì)大鼠的總膽汁酸代謝影響

根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中總膽汁酸（TBA）實(shí)際濃度。結(jié)果見(jiàn)表1和圖2。

表1 三黃瀉心湯及其有效組分灌胃大鼠24 h內(nèi)總膽汁酸的濃度 (S, 單位:μmol﹒L-1;n=6)

圖2 三黃瀉心湯及其有效組分對(duì)大鼠的總膽汁酸代謝影響差異(單位：μmol﹒L-1；n=6)

以上結(jié)果表明各組之間與空白組對(duì)比，經(jīng)SPSS 21.0分析，組間具有顯著性差異（P＜0.05）。經(jīng)對(duì)比分析數(shù)據(jù)，正常大鼠灌胃三黃瀉心湯及其有效組分后0～2 h、4～10 h血清膽汁酸呈一定的降低趨勢(shì)，TBA變化趨勢(shì)整體比對(duì)照組平緩。其中：A組（大黃素+鹽酸小檗堿+黃芩苷配比組）和B組（大黃素+鹽酸小檗堿配伍組）在24 h內(nèi)表現(xiàn)出相似的TBA變化趨勢(shì)，而單獨(dú)灌胃大黃素（C組）或中藥復(fù)方三黃瀉心湯（D組）大鼠后，TBA變化趨勢(shì)與A組和B組變化有所不同，具體表現(xiàn)為6 h這個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈升高趨勢(shì)，且與空白組具有較大差異。D組（三黃瀉心湯組）變化趨勢(shì)較對(duì)照組最大，對(duì)TBA的降低作用表現(xiàn)最大。

3 討論

3.1 三黃瀉心湯及其有效組分對(duì)正常大鼠的總膽汁酸代謝影響

健康成人膽汁酸儲(chǔ)存量大約為3～4 g。膽汁酸貯存庫(kù)每天大約循環(huán)8～12次，主要發(fā)生在進(jìn)餐后。人體每天膽汁酸合成量大約為0.4～0.6 g，用于補(bǔ)償膽汁酸隨糞便排出而造成的損失。有文獻(xiàn)報(bào)道[10]，人體中血清總膽汁酸的變化是隨不同時(shí)間變化而變化的。正常大鼠灌胃三黃瀉心湯及其有效組分后24 h內(nèi)血清TBA表現(xiàn)出組間差異，并總體表現(xiàn)出血清膽汁酸降低的趨勢(shì)。在灌胃后2 h內(nèi)，還有3 h、5 h、8 h、12 h這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出較大的差異，正常組表現(xiàn)為變化較大，而給藥后TBA變化較平緩。這可能與三黃瀉心湯及其有效組分可促進(jìn)總膽汁酸的排泄有關(guān)。本課題后期將收集正常大鼠給藥后24 h內(nèi)糞便，進(jìn)行TBA的檢測(cè)分析，以確證這個(gè)猜想。

經(jīng)對(duì)比分析數(shù)據(jù)，A組和B組在24 h內(nèi)表現(xiàn)出相似的TBA變化趨勢(shì)，在0～1 h、2～4 h、4～6 h、8～10 h與空白組具有較大差異；而單獨(dú)灌胃大黃素或中藥復(fù)方三黃瀉心湯灌胃大鼠后，TBA變化趨勢(shì)與A組和B組變化有所不同，具體表現(xiàn)為1～3 h、4～6 h、8～12 h與空白組具有較大差異。分析可能是因?yàn)楣辔覆煌幬飳?duì)膽汁酸的影響造成血清TBA的變化，這對(duì)后期與膽汁酸代謝相關(guān)的疾病病理模型研究中時(shí)間點(diǎn)的選擇和藥物選擇提供一定的依據(jù)。

3.2 三黃瀉心湯及其有效組分對(duì)大鼠的總膽汁酸代謝影響具有臨床指導(dǎo)意義

膽汁酸是膽固醇的最終產(chǎn)物并且是消除人體多余的膽固醇的主要途徑之一。通過(guò)與多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的直接接觸，膽汁酸可能受到藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。膽汁酸是膽固醇的最終產(chǎn)物并且是消除人體多余的膽固醇的主要途徑之一。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，血清膽汁酸可通過(guò)激活特異性核受體調(diào)節(jié)葡萄糖、脂肪酸、脂蛋白的合成、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝。因此，本課題采用三黃瀉心湯及其有效組分對(duì)正常大鼠血清TBA的代謝影響，可為后期的與膽汁酸相關(guān)的疾病或肝膽代謝性疾病的研究奠定一定的參考基礎(chǔ)。

已經(jīng)有學(xué)者[10]探究了正常人體血清TBA和7α-羥基-4-膽甾烯-3-酮（7a-hydroxy-4-cholesten-3-one,C4）的晝夜變化規(guī)律，研究結(jié)果表明血清TBA在進(jìn)餐后1 h和5 h濃度達(dá)到峰值，這與共軛膽汁酸變化規(guī)律一致；C4的變化與進(jìn)餐無(wú)關(guān)，與晝夜節(jié)律相關(guān)，主要3 h和12 h達(dá)到峰值，這與非共軛膽汁酸變化規(guī)律一致。C4是由膽固醇生物化學(xué)合成膽汁酸的中間體。它的前體7α-羥基膽固醇由膽固醇通過(guò)肝膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）產(chǎn)生。血清C4濃度反映膽汁酸的合成途徑。由于膽汁酸合成速率具有晝夜節(jié)律，因此血清C4值在一天中也變化。然而文獻(xiàn)報(bào)道的膽汁酸變化時(shí)間節(jié)點(diǎn)與本課題中大鼠灌胃三黃瀉心湯及其有效組分后血清TBA變化規(guī)律的內(nèi)在聯(lián)系需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。