，

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市衛(wèi)生監(jiān)督所， 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

土壤鹽漬化作為一種非生物脅迫因子，已成為除干旱外影響作物生長發(fā)育、導(dǎo)致減產(chǎn)的第二大生態(tài)逆境。全球不同類型的鹽堿地達(dá)10億hm2，大約占可耕地面積的10%，我國的東北、西北、華北、新疆、甘肅等干旱和半干旱地區(qū)，鹽荒地和鹽漬化耕地面積達(dá)2×107hm2和6.7×106hm2，大約占可耕地面積的25%[1]。鹽害使植物水分平衡失調(diào)、物質(zhì)代謝紊亂、光合機(jī)構(gòu)受損。但植物細(xì)胞在長期進(jìn)化過程中，也形成了一定的耐鹽和抗鹽機(jī)制。植物在幼苗階段對環(huán)境中的逆境信號感受最為敏感，而此時(shí)也是對其進(jìn)行代謝調(diào)控的最佳生理活躍期。通過外源調(diào)控措施增強(qiáng)光合碳代謝，為氮代謝提供充足的碳架和還原力是改善和減輕鹽害的重要途徑。一氧化氮(NO)作為植物組織中廣泛存在的內(nèi)源性信號分子，不僅參與了植物從種子萌發(fā)、形態(tài)建成、呼吸代謝、衰老和細(xì)胞程序性死亡(PCD)等生理過程，而且在植物對逆境脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[1]。研究證實(shí)，外源NO通過提高抗氧化酶活性和抗氧化劑含量，降低活性氧(ROS)和過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的積累，增強(qiáng)了棉花(GossypiumhirsutumL.)幼苗的抗冷性[2]；緩解鎘脅迫對玉米(Zeamays)幼苗造成的生長抑制，增強(qiáng)其對鎘毒害的抗性[3]；誘導(dǎo)鹽脅迫下水稻(Oryzasativa)葉片的抗氧化酶活性，增加耐鹽相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本[4]。而NO對鹽脅迫下南瓜幼苗早期碳代謝的影響未見報(bào)道。南瓜作為糧、菜、油、飼兼用作物，在我國的三北地區(qū)廣泛種植，尤其在東北，耕作層土壤的返鹽期和南瓜生長發(fā)育的苗期在時(shí)間上同步與疊加，造成苗期鹽害。本試驗(yàn)以硝普鈉為外源分子信號——NO，研究其對鹽脅迫下供試材料南瓜種子萌發(fā)和幼苗早期碳代謝及相關(guān)酶活性的影響，探討外源NO緩解南瓜鹽脅迫的生理機(jī)制，探索提高南瓜耐鹽性的途徑。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試南瓜品種為銀輝2號[Cucurbitamoschata(Duch.)Yinhui2]，由齊齊哈爾市種子經(jīng)銷處提供。NO供體為硝普鈉[Na2Fe(CN)5](Sodium nitroprusside，SNP)，購自Sigma公司，純度為98.5%。先配制成100 mmol/L母液，4 ℃保存，用時(shí)按所需濃度稀釋[5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 種子萌發(fā)脅變設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2014年3—7月在齊齊哈爾大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。精選大小和飽滿度一致的南瓜種子，先經(jīng)0.1%的KMnO4消毒后，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用0，50，150，250 mmol/L的NaCl(對照、輕、中、重度脅迫)分別復(fù)合0，30，90，150μmol/L的SNP浸種6 h。試驗(yàn)的10個(gè)處理分別以(N0S0、N0S30、N0S90、N0S150、N50S30、N50S90、N50S150，N150S30、N150S90、N150S150……N250S150)表示，將各處理置于人工氣候培養(yǎng)箱中(28 ℃，13 h/11 h光周期)發(fā)芽(30粒/皿)。為保持處理濃度恒定，各處理液平行定量補(bǔ)充。以胚根長2～3 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天記載發(fā)芽種子數(shù)，第5天進(jìn)行種子發(fā)芽參數(shù)的測定。

表1 外源NO對NaCl脅迫下南瓜種子萌發(fā)的影響(平均數(shù)±SE)

處理 發(fā)芽率 發(fā)芽勢 N0N50N150N250N0N50N150N250S087.49±1.38b88.16±3.67c57.32±1.02b29.41±2.04b47.13±2.59c39.12±0.87b30.51±2.64b26.34±1.07abS30 88.11±2.14b91.35±1.87b60.55±2.91b33.30±1.09ab 53.16±1.71b42.38±2.75b33.54±0.85b29.42±3.01aS90 89.95±2.37a93.41±1.07a76.34±1.98a40.69±2.03a56.94±2.88a48.26±1.96a41.88±2.77a28.87±0.92aS15084.67±0.90c75.79±2.34d51.49±0.89c20.08±1.22c45.89±1.58c29.78±2.00c20.175±0.59c19.56±2.64c

注：表中同列不同小寫字母表示p<0.05水平差異顯著。下同。

1.2.2 SNP濃度的篩選和苗期脅變處理

以預(yù)試驗(yàn)中150 mmol/L的NaCl為影響種子萌發(fā)和幼苗生長的致害處理，分別添加0，30，60，90，120，150，180μmol/L的SNP，培養(yǎng)4 d后，南瓜幼苗相對生長量呈現(xiàn)隨SNP濃度遞增而先升后降的變化趨勢，其中選出相對生長量最大的90μmol/L SNP作為處理濃度。每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)60粒種子。

將催芽后的種子播于細(xì)砂經(jīng)高溫滅菌(130 ℃，3 h)的花盆中(12粒/盆)，于實(shí)驗(yàn)室室溫下(23 ℃±2 ℃)自然光照培養(yǎng)，出苗后以Hongland營養(yǎng)液澆灌。待幼苗至3葉1心時(shí)，每盆保留生長整齊一致的幼苗8株，共30盆[5]。

試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：分別為處理Ⅰ(對照)：Hongland營養(yǎng)液(ck)；處理Ⅱ：Hongland營養(yǎng)液+150 mmol/L的NaCl；處理Ⅲ：Hongland營養(yǎng)液+90μmol/L的SNP；處理Ⅳ：Hongland營養(yǎng)液+150 mmol/L的NaCl+90μmol/L的SNP。每天用相應(yīng)的處理液定量澆灌2次(100 mL/盆/次)。分別于處理后的第4、8、12天進(jìn)行光合碳代謝相關(guān)指標(biāo)的測定，每次取樣4株，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。

1.3 測定項(xiàng)目和方法

1.3.1 種子發(fā)芽參數(shù)的測定

發(fā)芽率(%)=(第5天發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(第3天發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.3.2 光合色素含量的測定

用乙醇丙酮混合液暗提取24 h，測定663、645、470 nm的光吸收值，計(jì)算葉綠素和類胡蘿卜素含量[6]。

1.3.3 碳代謝及相關(guān)酶活性的測定

可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法[6]；1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPcase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPcase)活性分別采用偶聯(lián)法和比色法測定[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較(p<0.05)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對NaCl脅迫下南瓜種子萌發(fā)的影響

表1顯示，南瓜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均隨NaCl濃度的升高而降低，N150S0和N250S0處理，發(fā)芽率分別降至對照的65.52%和33.61%，發(fā)芽勢降低了35.26%和44.11%(p<0.05)，說明中、重度鹽害顯著抑制了南瓜種子的萌發(fā)。復(fù)合30～90μmol/L的SNP浸種處理，不同程度提高了中、重度鹽脅迫下南瓜種子的發(fā)芽率，N150S30、N150S90和N250S30、N250S90處理發(fā)芽率分別較對照提高了5.64%、33.18%和13.22%、38.35%，90μmol/L的SNP處理均達(dá)差異顯著水平(p<0.05)。N150S90處理，南瓜種子發(fā)芽勢達(dá)對照的1.37倍(p<0.05)，但對重度脅迫處理，發(fā)芽勢僅提高了9.61%，未達(dá)到差異顯著水平(p<0.05)。復(fù)合高劑量SNP(150μmol/L)浸種，發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈同步下降趨勢。說明適宜濃度外源SNP可以有效緩解中度鹽害對南瓜種子萌發(fā)造成的傷害，促進(jìn)種子萌發(fā)，但過高濃度則產(chǎn)生抑制效應(yīng)，加重鹽害。

2.2外源NO對NaCl脅迫下南瓜幼苗葉片葉綠素、類胡蘿卜素含量的影響

葉綠素是光合作用中最有效和最重要的色素，其含量在一定水平上影響南瓜苗期同化外源物質(zhì)和進(jìn)行光合積累的能力，并最終影響南瓜產(chǎn)量[5]。由圖1可見，正常生長條件的南瓜葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量隨幼苗生長而逐漸升高。單純鹽脅迫，葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著下降。處理4 d時(shí)，分別較對照下降了21.88%和24.64%，處理結(jié)束后，檢出率僅為對照的72.59%和62.82%(p<0.05)，說明鹽脅迫使南瓜葉片的光合機(jī)構(gòu)受損，電子傳遞和光合磷酸化的偶聯(lián)機(jī)制遭到破壞。且從變化趨勢上看，處理達(dá)8 d時(shí)，葉綠素和類胡蘿卜素含量仍為正增長，增幅分別為11.54%和9.62%；處理后12 d時(shí)，已呈負(fù)增長態(tài)勢，分別較8 d處理下降了7.39%和14.03%，但葉綠素含量仍高于處理初期，而類胡蘿卜素含量僅為初期處理的94.23%。單純SNP處理，顯著提高了光合色素的含量水平。但兩者不同的是，葉綠素含量在處理初期和中期(4～8 d)顯著升高，分別比對照增加了12.02%和11.74%(p<0.05)，此后升幅減小(8.11%)但仍顯著高于對照；而類胡蘿卜素含量則在(4～8 d)時(shí)與對照差異不顯著，后期大幅升高，增幅達(dá)23.08%(p<0.05)。復(fù)合SNP后，顯著提高了鹽害下南瓜葉片的光合色素含量。處理后4 d時(shí)，葉綠素和類胡蘿卜素含量分別比鹽脅迫提高了12.64%和21.15%；處理結(jié)束時(shí)，增幅已分別達(dá)到鹽害的42.02%和85.71%(p<0.05)。

圖1 外源NO對鹽脅迫下南瓜幼苗葉片光合色素含量的影響

圖2 外源NO對鹽脅迫下南瓜葉片可溶性糖含量(a)、RuBPcase(b)和PEPcase(c)活性的影響

2.3外源NO對NaCl脅迫下南瓜幼苗葉片可溶性糖含量、RuBPcase和PEPcase活性的影響

150 mmol/L NaCl脅迫，南瓜葉片可溶性糖含量在處理初、中期(4～8 d)顯著高于對照，隨幼苗生長，處理結(jié)束時(shí)已降至對照水平。單純SNP處理，可溶性糖含量隨幼苗發(fā)育而升高，各處理時(shí)段均顯著高于對照。SNP復(fù)合處理4～8 d，可溶性糖含量分別較鹽害下降低了18.86%和13.33%，后期比鹽脅迫提高了21.56%。說明外源NO調(diào)控了碳流運(yùn)轉(zhuǎn)，將前期滲透調(diào)節(jié)積累的糖經(jīng)蘋果酸-草酰乙酸(MAL-OAA)穿梭，為谷氨酸的轉(zhuǎn)化提供碳架——α-酮戊二酸(α-KG)的同時(shí)，將產(chǎn)生的NADH通過迅速還原NO3-，促進(jìn)了碳流由碳代謝向氮代謝的轉(zhuǎn)換。RuBPcase是催化光合碳代謝中CO2固定的關(guān)鍵酶，其活性高低對光合速率產(chǎn)生重要影響。PEPcase是催化三羧酸循環(huán)回補(bǔ)反應(yīng)的重要酶。正常生長條件下，RuBPcase、PEPcase活性隨南瓜幼苗生長而提高；SNP不同程度提高了RuBPcase活性，但4～8 d時(shí)與對照差異不顯著，后期處理比對照高18.31%，達(dá)差異顯著水平，而PEPcase活性則與對照無差異。鹽脅迫使RuBPcase活性呈逐漸下降的趨勢。PEPcase活性在處理初期較對照下調(diào)了35.76%，8 d處理酶活略有回升，但處理結(jié)束時(shí)PEPcase活性仍下降至僅為對照的51.74%；SNP復(fù)合后，RuBPcase活性增幅由單純SNP處理的18.60%上升到復(fù)合鹽害逆境下的82.35%、PEPcase活性則由初始處理的29.19%進(jìn)一步上調(diào)至處理結(jié)束時(shí)的46.47%(圖2)。說明NO作為分子信號能有效啟動(dòng)南瓜幼苗對逆境的應(yīng)答，有助于提高鹽脅迫下南瓜幼苗光合碳同化能力的提高和碳流的轉(zhuǎn)化。

3 討 論

從自由基傷害學(xué)說的觀點(diǎn)出發(fā)，鹽害逆境下，南瓜種子和幼苗ROS的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)失衡，ROS的積累誘發(fā)膜脂過氧化，葉綠體的類囊體膜是對環(huán)境最為敏感和脆弱的生物膜，鹽害造成葉綠體膜結(jié)構(gòu)受損，葉片的光合損傷導(dǎo)致2種光和色素含量下降。此外，鹽環(huán)境下葉綠素酶活性升高，加速葉綠素的降解也是導(dǎo)致光和色素含量下降的重要原因。外源SNP顯著提高了鹽害環(huán)境下南瓜葉片的葉綠素及類胡蘿卜素含量，說明SNP作為活性氮能有效修復(fù)類囊體膜的結(jié)構(gòu)損傷，促進(jìn)膜蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定，降低葉綠素酶的活性，緩解了光合色素的下降，增強(qiáng)了南瓜幼苗光合碳代謝的能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，90μmol/L的SNP浸種，能顯著提高鹽脅迫下南瓜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，顯著緩解了鹽害導(dǎo)致的幼苗可溶性糖堆積，提高了碳同化酶RuBPcase、PEPcase的活性，光合碳同化的正常進(jìn)行為氮代謝提供了豐富的碳架和還原力，促使了碳流向氮代謝方向運(yùn)轉(zhuǎn)，提高了幼苗的耐鹽性，促進(jìn)了南瓜幼苗的早期發(fā)育和形態(tài)建成。