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(1.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室/農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 山西 太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院玉米研究所， 山西 忻州 034000；3.山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所， 山西 太原 030031)

蕓豆(PhaseolusvulgarisLinn.sp.)學名菜豆，是普通菜豆(如小黑蕓豆、小白蕓豆等)和多花菜豆(如圓奶花蕓豆H、N、D、X等)的總稱[1]。蕓豆在我國種植面積廣泛[2]，蕓豆籽粒營養(yǎng)豐富，富含蛋白、碳水化合物、膳食纖維及多種人體必需的維生素和礦物質(zhì)[3]，食藥同源，是現(xiàn)代功能食品開發(fā)的重要資源[4]。然而，在蕓豆的長期育種過程中，篩選和育種目標太過單一，造成了在選育過程中遺傳基礎狹窄的限制，所以尋找打破狹窄的遺傳基礎的方法，加快蕓豆的種質(zhì)創(chuàng)新成為需要解決的問題。化學誘變具有特異性強，誘變后代較易穩(wěn)定遺傳的特點?；瘜W誘變是指利用化學誘變劑處理植物材料，以誘發(fā)可以遺傳的突變，然后根據(jù)育種目標，對這些變異進行鑒定、選擇和固定，育成需要的遺傳穩(wěn)定的品系或品種[5]。通過化學誘變已得到一些有價值的材料。Gustafsson等[6]用芥子氣處理大麥獲得突變體，Laudencia-Chingcuanco等[7]從創(chuàng)建的六倍體小麥EMS突變體庫中得到一個突變株，對這一突變株進行分離得到Dy 10和AX 1高分子質(zhì)量谷蛋白亞基缺陷突變株。其中甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate,EMS)目前在作物誘變育種中具有很高的應用價值，因其具有成本低、易操作、突變率高、染色體畸變相對較少、突變多為點突變且顯性突變率高等優(yōu)點[8]，使得EMS在作物化學誘變育種中應用效果明顯，得到了一致公認。

EMS分子具有多個活性烷基，可置換堿基中的氫原子，從而起到對堿基的烷化作用。EMS烷化作用主要發(fā)生于DNA的鳥嘌呤(G)上，烷基化的鳥嘌呤不再與胞嘧啶配對，而與胸腺嘧啶配對，導致G/C突變?yōu)?T，利用EMS誘變構(gòu)建突變體庫已成為獲得突變體、創(chuàng)新種質(zhì)和育種的有效手段[9]。據(jù)IAEA/FAO突變品種數(shù)據(jù)庫最新統(tǒng)計，截止2017年10月，聯(lián)合編入目錄的數(shù)據(jù)庫中有71個國家3 271個植物突變品種，其中通過EMS育成的品種有106個，我國利用EMS育成品種5個。各國學者對EMS誘變作物種子的適宜劑量進行了廣泛的研究。選擇適宜的劑量(劑量=處理液劑量×處理時間)是得到理想突變株、獲得最佳突變率、提高突變頻率的關(guān)鍵[10]。不同作物都有一定范圍的適宜劑量，在適宜劑量范圍內(nèi)，能更高效地產(chǎn)生突變體，并保持原有的優(yōu)良性狀[11]。Vicente-Doleara等利用不同濃度誘變西葫蘆，研究表明，致死率達40%，65 mmol/L的EMS處理液為最佳誘變處理條件[12]。胡志峰等研究發(fā)現(xiàn)，0.7%EMS誘變處理9 h和0.9%EMS誘變處理6 h的組合為金花菜種子最佳誘變條件[13]；王學征等研究表明，EMS處理濃度1.0%、誘導時間9 h是西瓜品系“W 1-17”種子最佳誘變條件[14]；孔德培等研究表明，0.6%EMS溶液對石系亞1號棉花種子處理8 h，誘變效果最佳[15]。詹遠華等研究表明，EMS處理豇豆種子，劑量以濃度0.3%EMS、時間3～4 h為宜。[16]

IAEA/FAO突變品種數(shù)據(jù)庫可見各國育成大豆、綠豆等豆類突變品種304個，俄羅斯育成蕓豆突變品種2個(Mukhranula，Svetlaya)，但數(shù)據(jù)庫中未見有利用EMS育成的蕓豆品種。利用EMS對蕓豆進行突變篩選和誘變育種的研究未見報道。本試驗以誘變劑EMS誘變處理蕓豆品種“英國紅”的純系干種子，采用5個EMS誘變濃度(0.0%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)，5個誘導時間(0，6，8，10，12 h)，分析誘變后的種子發(fā)芽率、相對出苗率和相對成苗率，確定EMS對蕓豆種子的最佳誘變條件，以期為蕓豆EMS誘變育種技術(shù)的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試蕓豆種

試驗材料為山西省農(nóng)業(yè)科學院玉米研究所雜糧研究室從蕓豆品種“英國紅”連續(xù)定向選擇出的純系干種子，種子飽滿、圓潤、無破損、色澤與大小均勻一致。

1.1.2 供試試劑

EMS誘變劑(甲基磺酸乙酯)原液購于山西基諾泰克生物科技有限公司，由美國SIGMA公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

參考國內(nèi)外學者應用EMS對蓖麻[17]、大豆[18]、小豆[19]、芝麻[20]、大麥[21]的誘變劑配置方法及處理條件，選擇本試驗中EMS處理的濃度和時間。試驗設5種濃度梯度×5種時間水平，共25個處理，每處理3次重復。5種濃度梯度：0.0%EMS，0.4%EMS，0.6%EMS，0.8%EMS，1.0%EMS(因素A 1-A 5)。浸種時間：0，6，8，10，12 h(因素B 1-B 5)。

試驗設不浸種不做EMS處理的蕓豆做對照。

1.2.1 不同濃度EMS溶液的配置

EMS溶液濃度配置見表1。

表1 EMS溶液濃度配置

溶液濃度原液95%酒精0.01mol/L磷酸緩沖液(pH=7.2)0.0(ck)005000.4284900.6374900.8464901.055490

1.2.2 種子處理

將蕓豆種子預先劃破種皮，用蒸餾水浸泡10 min，然后將浸泡過的種子擦干，100粒為一個處理，共60個處理；各處理在通風櫥中浸入500 mL不同濃度EMS溶液中，然后在28 ℃搖床上分別震蕩6，8，10，12 h。浸種結(jié)束后，在通風櫥中每個處理加入5%的1 mol/L硫代硫酸鈉(Na2S2O3)1 000 mL，混勻后，將溶液倒入廢液筒，將各處理種子蒸餾水沖洗10 min后，平鋪在濕潤濾紙上，稍干后，種子直接種在砂床發(fā)芽盒中，28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)催芽；廢液筒中廢液用20%的1 mol/L硫代硫酸鈉(Na2S2O3)溶液中和后，丟棄。

1.2.3 催芽方法和發(fā)芽率測定

EMS誘變處理且種子稍干后，將各處理種子及對照利用砂盒發(fā)芽，做好標記，置于(25±1)℃光照培養(yǎng)箱中。催芽7天后統(tǒng)計發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=(供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.2.4 測定成苗率的指標與方法

發(fā)芽試驗結(jié)束1周后將出苗種子移栽于溫室，移栽20 d后統(tǒng)計成苗率，計算相對成苗率。

相對出苗率(%)=(處理的出苗率/對照出苗率)×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。采用Excel 2007軟件進行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變處理對蕓豆種子發(fā)芽率的影響

2.1.1 EMS不同濃度對蕓豆種子發(fā)芽率的影響

如表2和圖1所示，未經(jīng)EMS處理與緩沖液浸種的蕓豆發(fā)芽率為100%，經(jīng)6，8，10，12 h緩沖液浸種未經(jīng)EMS溶液處理的蕓豆發(fā)芽率分別為60%、51%、29%、19%，說明磷酸緩沖液浸種時間長短與蕓豆發(fā)芽率存在顯著的負相關(guān)。當時間一定時，EMS不同濃度處理對蕓豆的發(fā)芽率有不同程度的影響。

6 h誘導時間下，0.4%、0.6%、0.8%、1.0%EMS的發(fā)芽率分別為74%、65%、66%、70%，高于6 h浸種未經(jīng)EMS處理的發(fā)芽率為60%，各濃度EMS處理蕓豆發(fā)芽率顯著高于對照(p<0.05)，說明6 h不同EMS濃度均對蕓豆發(fā)芽率有提升作用，6 h 0.4%EMS提升作用較大。

12 h誘導時間下，0.4%、0.6%、0.8%、1.0%EMS的發(fā)芽率分別為10%、6%、6%、8%，遠低于12 h浸種未經(jīng)EMS處理的發(fā)芽率(19%)，各濃度EMS處理的蕓豆種子發(fā)芽率顯著低于對照(p<0.05))，說明12 h誘導時間條件下不同EMS濃度對蕓豆發(fā)芽率有顯著的抑制作用。

8 h誘導時間下，0.6%EMS的發(fā)芽率顯著低于8 h浸種未經(jīng)EMS處理的發(fā)芽率(p<0.05)，1.0%EMS的發(fā)芽率顯著高于對照(p<0.05)，說明8 h誘導條件下，有提升有抑制。

10 h誘導時間下，0.4%、0.8%EMS的發(fā)芽率分別為33%、34%，顯著高于10 h浸種未經(jīng)EMS處理的發(fā)芽率(p<0.05)；1.0%EMS處理發(fā)芽率顯著低于對照(p<0.05)，產(chǎn)生抑制作用。所以，在蕓豆低誘導時間條件下，EMS不同濃度對發(fā)芽率有顯著的提升作用；在蕓豆高誘導時間條件下，EMS不同濃度對發(fā)芽率有顯著的抑制作用；在本試驗中8 h和10 h誘導條件下，EMS對蕓豆發(fā)芽率的影響呈現(xiàn)出不規(guī)則的抑制和提升作用。

表2 不同EMS處理組合對蕓豆種子發(fā)芽率的影響

濃度(%)處理時間(h)06810120100a60d51bc29b19a0.4100a74a49c33a10b0.6100a65c39d27b6c0.8100a66c53ab34a6c1.0100a70b54a9c8bc

圖1 不同EMS濃度對蕓豆種子發(fā)芽率的影響

2.1.2 EMS不同誘導時間對蕓豆種子發(fā)芽率的影響

未經(jīng)EMS處理與緩沖液浸種的蕓豆發(fā)芽率為100%。由表2和圖2可知，0.4%EMS濃度條件下，經(jīng)6，8，10，12 h誘導，100%蕓豆發(fā)芽率逐步下降為74%、49%、33%、10%。0.6%EMS濃度條件下，經(jīng)6，8，10，12 h誘導，100%蕓豆發(fā)芽率分別逐步下降為65%、39%、27%、6%。0.8%EMS濃度條件下，經(jīng)6，8，10，12 h誘導，100%蕓豆發(fā)芽率分別逐步下降為66%、53%、34%、6%。1.0%EMS濃度條件下，經(jīng)6，8，10，12 h誘導，100%蕓豆發(fā)芽率分別逐步下降為70%、54%、9%、8%。說明當EMS濃度處理一定時，隨著誘導時間的增大，對蕓豆發(fā)芽的抑制作用越大，蕓豆的發(fā)芽率均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢。

圖2 EMS不同誘導時間對蕓豆種子發(fā)芽率的影響

2.1.3 EMS濃度和誘導時間對發(fā)芽率的影響

清水與緩沖液浸種對作物種子發(fā)芽率有顯著影響。未經(jīng)EMS處理與緩沖液浸種的蕓豆發(fā)芽率為100%，經(jīng)6，8，10，12 h緩沖液浸種未經(jīng)EMS溶液處理的蕓豆發(fā)芽率分別為60%、51%、29%、19%。這4個蕓豆發(fā)芽率是磷酸鹽緩沖液浸泡時間所致，與EMS并無關(guān)系。如把誘導時間B 2作為先決條件，EMS濃度A 2作用于蕓豆，使得蕓豆發(fā)芽率由60%變?yōu)?4%，漲幅為23.33%；而如把EMS濃度A 2作為先決條件，誘導時間B 2使得蕓豆發(fā)芽率由100%變?yōu)?4%，減幅為26%。26%>21.31%，可視為A 2 B 2共同作用于蕓豆，誘導時間B 2對蕓豆發(fā)芽率的作用大于A 2。表3為先決條件不同時，EMS濃度或誘導時間對蕓豆發(fā)芽率的影響(如B 2 A 2代表6 h 0.4%EMS，表示先決條件為浸種6 h，芽率影響由0.4%EMS所致；A 2 B 2表示先決條件為0.4%EMS，芽率影響由浸種6 h所致)。

從表3可看出，EMS濃度為先決條件，芽率的漲幅最小為-94%，最大為-26%，誘導時間對蕓豆種子發(fā)芽率均是抑制作用；誘導時間為先決條件，芽率的漲幅最小為-70.00%，最大為23.33%，僅B 2 A 2，B 2 A 3，B 2 A 4，B 2 A 5，B 3 A 4，B 3 A 5，B 4 A 2，B 4 A 4等處理對蕓豆發(fā)芽率有促進作用。組合B 2 A 2，B 4 A 2漲幅相對較大。

表3 不同處理條件下蕓豆發(fā)芽率的漲幅

處理漲幅(%)處理漲幅(%)A2B2-26.00B2A223.33A2B3-35.00B2A310.00A2B4-33.00B2A48.33A2B5-30.00B2A516.67A3B2-51.00B3A2-5.88A3B3-61.00B3A3-25.49A3B4-47.00B3A41.96A3B5-46.00B3A53.92A4B2-67.00B4A221.43A4B3-73.00B4A3-7.14A4B4-66.00B4A417.86A4B5-91.00B4A5-71.43A5B2-90.00B5A2-55.00A5B3-70.00B5A3-70.00A5B4-94.00B5A4-65.00A5B5-92.00B5A5-55.00

表4 EMS不同濃度和處理時間對蕓豆種子萌發(fā)的影響

處理濃度處理時間(h)發(fā)芽率(%)相對出苗率(%)相對成苗率(%)A1B10.00100aA2B10.40100aA3B10.60100aA4B10.80100aA5B11.00100aA2B20.4674b96.51b94.40bA5B21.0670c89.83e88.65eA4B20.8666d91.17de90.12dA3B20.6665d93.50cd93.50cdA1B20.0660e100a100aA5B31.0854f72.83g72.65gA4B30.8853fg90.37e90.30eA1B30.0851gh100a100aA2B30.4849h95.5bc95.44beA3B30.6839i97.00b96.41bA4B40.81034j83.83f82.65fA2B40.41033j93.57cd93.50cdA1B40.01029k100a100aA3B40.61027k91.03de90.12deA1B50.01219l100a100aA2B50.41210m90.87de89.88fA5B41.0109m70.00g69.5gA5B51.0128mn80.54gh78.6gA4B50.8126n73.5g76.89gA3B50.6126n72.97g68.98g

2.2 EMS誘變處理對蕓豆種子出苗的影響

EMS濃度和處理時間影響蕓豆種子的發(fā)芽率，在0.05水平上差異顯著。相對出苗率和相對成苗率則影響不大。結(jié)果表明，不同的EMS濃度，不同時間的處理以及兩者互作的因素上對蕓豆的種子萌發(fā)呈顯著影響(p<0.05)。一般認為，經(jīng)過EMS誘變處理后植株存活50%的劑量(即半致死劑量LD50)為誘變敏感性指標，為可遺傳變異應該吸收的能量闕值，也是最佳誘變劑量[22]。結(jié)果表明，A 5 B 3，A 4 B 3處理為蕓豆種子EMS處理的適宜條件，其中0.8%EMS濃度處理8 h為最佳誘變條件。

3 討 論

EMS誘變處理對蕓豆籽粒發(fā)芽有顯著的抑制作用。不同濃度的EMS對蕓豆籽粒發(fā)芽抑制的時間效應明顯，6 h處理組，蕓豆發(fā)芽率為0.6%～0.8%，EMS濃度間差異不顯著，發(fā)芽率為0.4%～0.6%，EMS濃度間差異顯著(p<0.05)。8 h處理組，蕓豆發(fā)芽率為0.4%～0.8%，EMS濃度間差異顯著(p<0.05)，在0.8%～1%EMS濃度間沒有顯著性差異。不同EMS處理時間對蕓豆種子發(fā)芽抑制的濃度效應明顯。在0.4%～0.8%EMS處理濃度條件下，蕓豆籽粒發(fā)芽率在6～12 h處理組間呈顯著差異(p<0.05)，在0.8%以上高濃度EMS處理濃度條件下，蕓豆籽粒發(fā)芽率在6～10 h處理組間呈顯著差異(p<0.05)，在10～12 h處理組間沒有顯著性差異。由于不同的EMS濃度，處理時間和兩者間的互作效益都在影響著蕓豆種子的萌發(fā)和出苗成苗情況。以EMS濃度作為先決條件，誘導時間對蕓豆發(fā)芽率均是抑制作用，以處理時間為先決條件，不同濃度的EMS處理對蕓豆發(fā)芽有抑制也有促進。兩者相比，EMS誘變時間對蕓豆發(fā)芽率的抑制效應大于誘變濃度。這與胡志峰等[14]的研究結(jié)果不一致，可能是互作效應在不同作物間的影響效果不同導致。

EMS處理對育種材料的選育和創(chuàng)新種質(zhì)資源具有重大意義，而確定其最佳誘變條件成為了關(guān)鍵。不同作物對EMS的敏感性不一樣，用的濃度低，處理時間短則變異效應不明顯，所用EMS劑量過高，誘變處理時間太長，則容易導致作物致死速率加快，也不利于獲取目標材料，因此，確定最佳誘變條件則至關(guān)重要。孔德培等[23]利用0.6%EMS，8 h處理亞洲棉種子構(gòu)建了EMS種子突變庫。穆國俊等[24]利用0.5%EMS，4 h處理陸地棉冀棉20，獲得了纖維改良突變體材料。通過篩選出最適宜的EMS誘變條件對EMS誘變構(gòu)建蕓豆突變體同樣具有指導意義。目前已經(jīng)在擬南芥[25-26]、水稻[27]、大豆[28]等作物中構(gòu)建了突變庫。但是在蕓豆中的EMS誘變處理還未見報道。本研究中采用5個EMS誘變濃度(0.0%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)，5個誘導時間(0，6，8，10，12 h),分析誘變后的種子發(fā)芽率，最終篩選出對蕓豆種子適宜的誘變條件是0.8%EMS濃度和8 h處理時間。

4 結(jié) 論

EMS誘變處理對蕓豆發(fā)芽率有顯著的抑制效應；EMS誘變濃度對蕓豆發(fā)芽率的抑制效應小于誘導時間；EMS誘變處理對蕓豆的相對出苗率和相對成苗率無顯著影響；0.8%的EMS誘變濃度和8 h的誘導時間組合，是蕓豆種子的最佳誘變條件。

現(xiàn)如今，EMS化學誘變技術(shù)和分子標記相結(jié)合用于尋找突變位點和基因定位[29]，通過該技術(shù)可以進一步研究蕓豆領(lǐng)域的化學誘變，有必要結(jié)合相關(guān)基礎理論知識從宏觀到微觀從細胞到分子，從表型到機理去研究蕓豆，以便通過EMS誘變蕓豆拓寬蕓豆的種質(zhì)資源，構(gòu)建突變體庫。