宋志偉，陳露露，潘宇，鐘子楠，王晶

黑龍江科技大學(xué)環(huán)境與化工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150022

秸稈有效處理及資源化是目前備受關(guān)注的環(huán)境問題，微生物菌劑降解秸稈是近年來研究較多的秸稈生物處理方法（Zhang et al.，2018）。微生物菌劑處理秸稈是根據(jù)秸稈的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選取適宜的微生物菌種，分解秸稈中的有機質(zhì)和纖維結(jié)構(gòu)，使之轉(zhuǎn)化為CO2、水、礦物質(zhì)及熱量。目前，微生物菌劑處理秸稈通常采用與畜禽糞便或化肥配合，進行高溫堆肥和還田處理，也用于沼氣發(fā)酵的預(yù)處理，這些處理方法尚存在著一定的局限性。畜禽糞便本身即是寶貴的生物肥料，高溫堆肥受環(huán)境條件影響大，易有惡臭產(chǎn)生，對環(huán)境造成污染；與簡單的秸稈還田相比，施加化肥減少了土壤中固氮菌、放線菌等有益菌的數(shù)量；適用于沼氣發(fā)酵的復(fù)合微生物菌種正處于研究探索階段（錢海燕等，2012；張瑞，2014；鮑士旦等，2000）。

本文選取了EM、VT1000、強興3種商品菌劑，將其直接作用于粉碎成末并與果皮蔬菜混合垃圾按不同配比混合的秸稈物料，無需發(fā)酵。通過分析微生物菌劑處理后物料理化性質(zhì)、半纖維素降解率和微生物種群結(jié)構(gòu)的變化，探討不同微生物菌劑和原料配比對物料理化性能和降解性能的影響，以期尋求一種秸稈快速高效降解的途徑。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗原料

（1）水稻秸稈：取自黑龍江科技大學(xué)周邊農(nóng)村，風干后剪切成2.0 cm左右的小段，再用粉碎機將秸稈粉碎過篩至1 mm以下，備用。

（2）果皮、菜葉混合垃圾：取自黑龍江科技大學(xué)周邊市場，于65 ℃烘干箱中風干至恒重后粉碎過篩至1 mm以下，備用。

將粉碎至 1 mm以下的水稻秸稈和果皮蔬菜按質(zhì)量比分別為 3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、3∶4、3∶5、3∶6的比例充分混勻，備用。供試原料的理化性質(zhì)見表1。

1.2 促腐劑

（1）EM菌劑（商品名）：云酵生物科技有限公司生產(chǎn)，其中主要包括芽孢桿菌、放線菌、酵母菌、木霉菌等多種有益微生物，有效活菌數(shù)達2000億/克。

（2）VT1000菌劑（商品名）：北京沃土天地生物科技股份有限公司生產(chǎn)，主要成分有乳酸菌、芽孢桿菌、放線菌、酵母菌、霉菌等，菌落密度（CFU）為 2108 ind·mL-1。

（3）強興菌劑（商品名）：北海強興生物科技有限公司生產(chǎn)，主要成分有細菌、真菌、酵母菌等多種有效物質(zhì)。

1.3 實驗設(shè)計

（1）反應(yīng)容器：自制，材質(zhì)為PP（聚丙烯），長×寬×高=17 cm×11.7 cm×5.6 cm，體積750 mL，透明方型加厚型塑料保鮮盒；于保鮮盒底部和頂部的中間位置等距開孔52個，小孔直徑約1～2 mm；保鮮盒較長兩側(cè)各開孔40個。

（2）水稻秸稈處理：共進行4組試驗，分別選取市面上應(yīng)用較多的EM、VT1000、強興3種商品菌劑作為促腐劑，按菌劑用量說明書要求等比例換算加入菌劑，以未加菌劑處理作為空白對照。

向不同配比的混合物料中添加微生物菌劑充分混勻后，加水調(diào)節(jié)含水率為 60%（手握物料液體滲出但不成滴），置于自制的反應(yīng)器中進行堆腐處理，每組試驗均設(shè)置3個平行。測試取樣時在每個平行樣中各取 1/3后物料混合均勻后進行測定，試驗周期為45 d。分別于第0天和第45天取樣測定物料的全碳、全氮、速效鉀、速效磷和半纖維素含量；試驗周期結(jié)束后測定物料中微生物種群結(jié)構(gòu)。

1.4 項目分析及方法

（1）理化性質(zhì)分析：采用總有機碳分析儀測定全碳含量；凱氏定氮法測定全氮含量；浸提火焰光度法測定速效鉀含量；，0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定速效磷含量（潘曉輝，2007）。

（2）降解率分析：半纖維素測定采用差重法（張蓓，2012）。準確稱取粉碎后的樣品1.000 g，置于250 mL三角瓶中，加入2 mol·L-1鹽酸70 mL，然后放入已沸的高壓鍋中，100 ℃保溫50 min，過濾至中性（濾液由淺黃色變?yōu)闊o色透明），依次用體積分數(shù)為95%的乙醇、無水乙醇和丙酮洗滌2次，將殘渣置于 80 ℃烘箱中烘干至恒重，記錄質(zhì)量W1，1.000-W1即為半纖維素含量。

（3）微生物種群構(gòu)成分析：采用高通量測序技術(shù)，測序?qū)嶒灹鞒倘鐖D1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種菌劑對物料理化性質(zhì)的影響

2.1.1 對全碳的影響

由表2可知，EM處理的物料全碳含量最低的為物料配比3∶2，其全碳含量為8.19%；VT1000處理的全碳含量最低的為物料配比 3∶5，全碳含量為9.11%；強興菌劑處理的全碳含量最低的為物料配比3∶5，全碳含量為10.25%。3種菌劑作用于不同配比原料，其全碳含量的變化無明顯規(guī)律，全碳含量變化幅度由高到低順序依次為EM菌劑、VT1000菌劑、強興菌劑，說明EM菌劑降解秸稈中有機質(zhì)的能力最強，其次是VT1000菌劑。EM菌劑在物料配比為3：2時對物料中有機質(zhì)的降解效果最好。

表2 不同菌劑處理后物料全碳含量Table 2 Total carbon content of the material treated by different microbial agents %

表1 供試原料的基本理化性質(zhì)Table1 Basic properties of the materials tested

圖1 高通量測序?qū)嶒灹鞒蘁ig. 1 Process of high-throughput sequencing

2.1.2 對全氮的影響

由圖2可知，加菌劑的3組物料全氮下降幅度較無菌劑組更高，說明菌劑中微生物對物料全氮消耗具有一定的促進作用。其中，VT1000處理后物料全氮下降幅度較高的是物料配比為3∶1和3∶2的處理，分別為55.24%和55.02%；EM 處理后物料全氮下降幅度最高的是物料配比為3∶2的處理，下降幅度為 54.75%；強興菌劑處理后全氮下降幅度最高的是配比為3∶2的處理，下降幅度為45.21%。分析可知，不同菌劑處理后物料的全氮下降幅度從高到低順序依次為VT1000菌劑組、EM菌劑組和強興菌劑組，與其對應(yīng)的最佳原料配比均為3∶2。

圖2 不同菌劑對物料全氮下降幅度的影響Fig. 2 Descent range of total nitrogen of materials tested in different microbial agents

2.1.3 對速效磷的影響

由圖3可知，加入菌劑的3組物料中速效磷含量上升幅度明顯高于空白對照組，說明菌劑中微生物的活動對物料速效磷含量的提高具有促進作用。其中，VT1000和強興菌劑處理后物料速效磷的上升幅度隨物料中果皮蔬菜混合垃圾比重的增加而增加；添加EM菌劑物料中速效磷的上升幅度以3∶3配比為分界，混合物料中果皮蔬菜混合垃圾含量較高的為物料配比為 3∶4、3∶5、3∶6 的處理，其速效磷上升幅度分別為 70.42%、71.02%、74.90%；而物料中秸稈比例較高的處理（3∶0、3∶1、3∶2）速效磷上升幅度分別為2.66%、44.19%、51.49%，前者速效磷的上升幅度明顯高于后者。

圖3 不同菌劑對物料速效磷增長幅度的影響Fig. 3 Increment range of available phosphorus of materials tested in different microbial agents

2.1.4 對速效鉀的影響

由圖4可知，菌劑處理的3組物料速效鉀上升幅度均比空白組有明顯提高，說明菌劑中微生物的活動對物料速效鉀含量的提高具有明顯的促進作用。其中，VT1000菌劑處理的物料，速效鉀上升幅度最高的物料配比為3∶3，其次是3∶2，上升幅度分別為83.60%、80.46%；EM菌劑處理的物料，速效鉀上升幅度最高的配比為 3∶2，上升幅度為75.34%；強興菌劑處理后速效鉀上升幅度最高的配比為3∶4，上升幅度為72.11%。分析可知，VT1000菌劑對物料速效鉀含量提高的幅度明顯高于其他菌劑，且受物料本底值影響較小，不同原料配比速效鉀上升幅度差距不大，說明VT1000菌劑在提高速效鉀方面適用的比例范圍更廣且更優(yōu)。

圖4 不同菌劑對物料速效鉀增長幅度的影響Fig. 4 Increment range of available potassium of materials tested in different microbial agents

2.1.5 對C/N的影響

由圖 5 可知，對照組不同配比（3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、3∶4、3∶5、3∶6）物料的 C/N 依次為 38.53、22.93、19.40、18.04、17.08、15.65、14.93，其中，3∶4 配比處理下降幅度最高，為62.87%；EM菌劑處理物料的 C/N 依次為 21.49、15.11、14.81、14.44、12.70、12.49、11.88，除3∶0空白外，3∶2配比處理下降幅度最高，為73.26%；VT1000菌劑處理物料的C/N依次為23.52、20.49、16.78、14.68、13.91、13.74、13.12，除3∶0空白外，3∶2配比處理下降幅度最高，為 72.39%；強興菌劑組處理物料的 C/N依次為20.43、16.13、15.59、14.59、14.36、14.19、13.67，除 3∶0空白外，3∶1配比處理下降幅度最高，為74.27%。

綜上所述，3種菌劑處理物料，C/N下降幅度從高到低依次為EM、強興和VT1000，其中EM、VT1000兩種菌劑處理的物料在原料配比為 3∶2時C/N下降幅度最高，分別為73.26%和72.39%；強興菌劑處理的物料C/N在原料配比為3∶1時下降幅度最高，為74.27%。

2.2 3種菌劑對物料降解性能的影響

圖6 不同菌劑處理物料半纖維素降解率Fig. 6 Hemicellulose degradation rate in different microbial agents

圖5 不同菌劑處理物料的C/N變化Fig. 5 Change of the C/N ratio of materials tested in different microbial agents(a) Blank control group; (b) EM group; (c) VT1000 group; (d) QX group

由圖6可知，隨著物料中果皮蔬菜混合垃圾所占比例的不斷增加，4組物料半纖維素降解率均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。其中，VT1000菌劑對物料半纖維素的降解率最高，當水稻秸稈與果皮蔬菜混合垃圾配比為3∶2時，半纖維素降解率達到最高，為60.09%；EM菌劑與強興菌劑的半纖維素降解率相差不大，EM 菌劑于 3∶2時達到峰值，為52.62%；強興菌劑于3∶3時達到峰值，為54.79%。原料配比3∶2最適宜微生物對秸稈進行降解，且降解效果最佳的為VT1000菌劑。

2.3 不同菌劑對物料微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

菌劑中微生物種群結(jié)構(gòu)是影響物料理化性質(zhì)和半纖維素降解率的關(guān)鍵，本研究采用高通量測序技術(shù)，對比分析了經(jīng)EM菌劑、VT1000菌劑、強興菌劑分別處理后，配比為3∶2的物料中細菌群落和真菌群落的相對豐度和優(yōu)勢菌群，從微生物學(xué)角度探討3種菌劑對物料微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。

2.3.1 物料中細菌相對豐度

由圖7可知，不同菌劑處理后物料細菌門級分類的優(yōu)勢菌群為 Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）和 Chlorobacteria（綠彎菌門），4組處理相對豐度均占75%以上。其中 Proteobacteria相對豐度最大，為24.41%～29.74%；但Proteobacteria相對豐度在4個處理之間差異不大，僅EM處理略高于空白和其他兩組處理。

圖7 不同菌劑處理物料細菌的優(yōu)勢菌群相對豐度Fig. 7 Relative abundance of dominant bacteria of materials at phylum level in different microbial agentsWU_1 was used as control sample; EM_1 was treated with EM; VT_1 was treated with VT1000; QX_1 was treated with strong bacilli; Sample size n=4. The same below

2.3.2 物料中真菌相對豐度

由圖8可知，不同菌劑處理后物料真菌門級分類的優(yōu)勢菌群為 Ascomycota（子囊菌門）、Zygomycota（接合菌門）、basidiomycota（擔子菌門）和Unclassified-k-Fungi（未經(jīng)分類的真菌）；其中，Ascomycota的相對豐度最大，為 70.00%～98.06%，占據(jù)絕對優(yōu)勢菌群的地位。與對照組相比，加入菌劑的3組處理，Ascomycota的相對豐度均有不同程度的降低，降低幅度從高到低依次為EM、強興、VT1000，與物料C/N降低幅度由高到低的順序相同，說明Ascomycota與物料C/N的變化存在一定關(guān)聯(lián)。

圖8 不同菌劑處理物料真菌的優(yōu)勢菌群相對豐度Fig. 8 Relative abundance of dominant fungi of materials at phylum level in different microbial agents

3 討論

微生物菌劑處理秸稈是根據(jù)秸稈的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選取適宜的微生物菌種，分解秸稈中的有機質(zhì)和纖維結(jié)構(gòu)，使之轉(zhuǎn)化為CO2、水、礦物質(zhì)及熱量。由上述研究結(jié)果可知，不同菌劑處理對秸稈混合物料的理化性質(zhì)、降解性能和微生物種群結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生了不同程度的影響。

3種菌劑處理物料的全碳含量與空白組相比，均有不同程度的降低，說明菌劑對物料中有機質(zhì)的降解具有促進作用，其中，碳素是微生物代謝的能源，其含量能反映出微生物的代謝程度（余文娟等，2014）。本研究中所用的不同菌劑中的微生物其利用有機質(zhì)進行代謝呼吸能力也不盡相同，微生物通過自身作用，代謝和消耗物料中的大分子有機物質(zhì)，使其中一部分有機物質(zhì)被降解為更容易被利用的小分子有機物，形成腐殖質(zhì)，而另一部分則以CO2的形式散失（Michel et al.，1996）。

氮源對菌體的迅速增長起到至關(guān)重要的作用，是滿足微生物自身生長繁殖代謝等活動所必需的營養(yǎng)元素。添加菌劑后，其中的微生物活動加速了物料中全氮的分解，物料中的有機氮被快速礦化，大大提高了氮素的降解速度，一部分為微生物自身代謝和繁殖提供氮源，一部分變成氨氣迅速流失，從而導(dǎo)致物料中總氮含量下降（武志海等，2017）。VT1000菌劑中微生物對物料全氮的利用效果較好，最適宜原料配比為3∶2，可能是由于 VT1000菌劑中的優(yōu)勢菌種較其他兩種菌劑對氮的需求量更高，利用氮源合成自身所需的能力更強所致。

磷可以有效提高植物抗擊惡劣環(huán)境的能力（張福鎖，1993）。不同菌劑作用下物料速效磷的上升幅度從高到低順序依次為EM菌劑、VT1000菌劑和強興菌劑，說明物料中果皮蔬菜混合垃圾的含量越高越有利于微生物提高物料中的速效磷含量。而不同菌劑處理物料對速效磷的提高幅度不同，可能與菌劑中所含的優(yōu)勢菌群或某種與速效磷相關(guān)的菌種的存在有關(guān)。

鉀對維持植物的光合作用、呼吸作用、養(yǎng)分運輸以及許多酶系統(tǒng)的功能有很大作用。隨著物料中果皮蔬菜混合垃圾所占比重的不斷增加，EM菌劑和強興菌劑使速效鉀提高幅度均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。說明，EM菌劑和強興菌劑提高物料中速效鉀的能力受物料本底值影響較大，EM菌劑對秸稈含量比較高的物料速效鉀提高效果更明顯，而強興菌劑則相反。因此，VT1000菌劑處理秸稈后提高物料中速效鉀的能力較強。

經(jīng)EM、VT1000、強興菌劑和無菌劑處理后，4組物料降解后C/N均有明顯下降。而處理前的物料C/N隨果皮蔬菜混合垃圾在物料中所占比重的增大而逐漸降低，4組物料下降幅度基本一致。有研究表明（Pedraza-Zapata et al.，2017），當物料中C/N較高時，微生物會通過多次的循環(huán)氧化，利用和消化過多的碳，直至形成適宜生長的C/N環(huán)境。

微生物對秸稈進行降解是其生長過程中的一系列酶系反應(yīng)的結(jié)果（史小麗，2001；姜潔，2010）。在不同菌劑處理秸稈過程中，果皮蔬菜混合垃圾的添加量過多和過少都不利于微生物對秸稈的降解。當秸稈中添加的果皮蔬菜混合垃圾過多時，物料結(jié)構(gòu)過于致密，透氣性差，制約了好氧菌的生長代謝活動，降低了微生物對半纖維素降解的速度（劉衛(wèi)星，2004）；當秸稈中添加果皮蔬菜混合垃圾過少時，物料中C/N過高，碳素營養(yǎng)過剩，氮素養(yǎng)分相對缺乏，營養(yǎng)的不平衡也限制了微生物的生長。

有研究顯示，Proteobacteria是細菌中最大的一個門，其中許多類群可以進行固氮作用，并且能夠適應(yīng)各種復(fù)雜的環(huán)境（Liu et al.，2014；羅培宇，2014），因此環(huán)境條件的變化對其分布和相對豐度影響不大。也有研究表明（張玉潔等，2017），生物炭在秸稈還田過程中有加速秸稈降解，提高土壤多樣性的作用，在對其進行 PCR-DGGE分析時發(fā)現(xiàn)Proteobacteria在細菌門中所占的比例明顯升高，說明Proteobacteria對秸稈的降解具有明顯的促進作用。Actinobacteria有促進土壤中動植物殘體腐爛的能力，可以有效促進秸稈腐解的過程（Lauber et al.，2008）。本研究中強興菌劑處理的Actinobacteria相對豐度最大，而EM、VT1000處理與空白相比卻降低了物料中Actinobacteria的相對豐度，這可能與 EM、VT1000兩種菌劑本身所含的微生物菌群有關(guān)，這兩種菌劑中其他的優(yōu)勢菌群的生長抑制了Proteobacteria的增加。Acidobacteria（酸桿菌門）是新近分出的一門細菌，廣泛分布在土壤及沉積物中，為嗜酸菌，相關(guān)研究較少，但它們在生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用。有研究顯示，物料中優(yōu)勢細菌類群相對豐度與物料理化性質(zhì)有一定的相關(guān)性（李聰，2013）。本研究中EM、VT1000、強興3種菌劑處理后的物料Acidobacteria相對豐度均明顯高于對照組，且VT1000菌劑處理后的物料Acidobacteria相對豐度最大，為11.12%，EM其次，為9.00%。這與試驗過程中物料全氮的下降規(guī)律和速效鉀的上升規(guī)律相符，說明Acidobacteria的相對豐度與物料全氮呈顯著負相關(guān)，而與物料速效鉀含量呈顯著正相關(guān)，這與王伏偉等（2015）研究得出的酸桿菌門相對豐度與土壤全氮含量呈顯著負相關(guān)的結(jié)論相一致。Bacteroidetes（擬桿菌門）包括三大類細菌，即擬桿菌綱、鞘脂桿菌綱和黃桿菌綱。很多擬桿菌綱的種類生活在人或動物的腸道中，鞘脂桿菌綱的重要類群為噬胞菌屬（Cytophaga），可以有效降解纖維素。楊騰騰等（2015）研究表明，Cytophaga hutchinsonii屬于擬桿菌門，具有很強的結(jié)晶纖維素降解能力并推測其存在第3種細胞結(jié)合型纖維素降解模式。EM、VT1000和強興3種菌劑處理的物料，優(yōu)勢菌群Bacteroidetes相對豐度較空白組均有顯著提高，其中VT1000菌劑組與EM菌劑組的提高幅度相差不大，分別為18.34%和 17.20%；強興菌劑組的提高幅度較小，為15.33%。由此也可說明VT1000菌劑處理物料半纖維素降解率較高的原因。Chlorobacteria（綠彎菌門）是一類通過光合作用產(chǎn)能的細菌，與擬桿菌門類群最近（Bryant et al.，2006），本試驗中，4組處理 Chlorobacteria相對豐度差距不大，相對豐度從高到低的順序依次為EM、VT1000、強興菌劑處理的物料和不加菌劑的空白組，該順序與4組處理中全碳含量由低到高的順序和速效磷增長幅度由高到低的順序相一致，然而其是否存在相關(guān)關(guān)系還有待進一步研究。

Unclassified-k-Fungi是一種未經(jīng)分類的門級真菌，加入菌劑的3組試驗Unclassified-k- Fungi相對豐度均明顯高于對照組，不同處理相對豐度由高到低的順序依次為 EM、強興、VT1000，該順序與物料C/N降低幅度由高到低的順序完全一致，說明Unclassified-k-Fungi是影響物料C/N的主要因素。Zygomycota和basidiomycota均為典型的腐生菌，前者主要分布于土壤、牲畜糞便或其他腐敗的有機物質(zhì)上，后者是真菌中最高等的一門，分布廣、數(shù)量大、種類多，能與植物共生形成菌根（mycorrhiza），有利于作物的栽培和造林；本研究中 EM菌劑處理的 Zygomycota和basidiomycota相對豐度明顯高于其他菌劑處理組，這可能是 EM 菌劑較其他菌劑對物料全碳降解效果更好的主要原因。

4 結(jié)論

（1）3種菌劑均對秸稈的全碳、全氮、C/N具有降低作用，對速效磷和速效鉀的含量具有提高作用；可加快半纖維素的降解。相對而言，EM菌劑對全碳、速效磷和 C/N的作用效果較好；VT1000菌劑對全氮、速效鉀和半纖維素的作用效果較好。

（2）各菌劑于物料配比3∶2時處理效果最佳，采用EM菌劑處理后的物料全碳和C/N含量分別為8.19%和14.44，速效磷上升幅度為51.49%；采用 VT1000菌劑處理后物料全氮下降幅度為55.24%，速效鉀上升幅度為 83.60%，半纖維素降解率為60.09%。

（3）采用高通量測序技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)對物料性能的影響，結(jié)果表明，EM菌劑處理的物料，優(yōu)勢菌群Unclassified-k-Fungi的相對豐度明顯高于其他菌劑的處理，這直接影響物料的 C/N變化；而 VT1000菌劑處理的物料的優(yōu)勢菌群Acidobacteria相對豐度明顯高于其他菌劑，其與物料中全氮和速效鉀存在一定的相關(guān)性。