何雨桐， 孫哲， 王剛

(四川大學(xué)生物材料工程研究中心，成都610064)

人體骨骼肌分布廣、體積大且血管豐富，通過(guò)肌肉注射的方式將編碼功能蛋白的基因傳遞到骨骼肌細(xì)胞中，以之為“工廠”在患者體內(nèi)“生產(chǎn)”治療性蛋白，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化、精準(zhǔn)化治療，是一種意義重大且前景廣闊的治療策略(Luetal.，2003a)。如何安全高效地將外源基因傳遞到肌肉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)是該策略成功的關(guān)鍵。盡管質(zhì)粒DNA(pDNA)可以被傳遞到肌肉細(xì)胞中表達(dá)，但由于直接注射pDNA易被降解、入胞效率低等，轉(zhuǎn)染效率并不理想。因此，人們一直致力于開(kāi)發(fā)各種基因傳遞策略來(lái)提高肌肉內(nèi)基因傳遞和表達(dá)效率，如電轉(zhuǎn)移法、超聲法和載體介導(dǎo)法等(Miretal.，1998；Guérin，2000；Lauritzenetal.，2002；Luetal.，2003b；Wells，2004；Leeetal.，2012)。本文探究了陽(yáng)離子聚合物——聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)作為基因載體，在骨骼肌原位基因傳遞體系中應(yīng)用的可能性，利用PEI/pDNA復(fù)合物和Pluronic L64聯(lián)用構(gòu)建了安全高效的基因傳遞體系(L/P/D)，其中，L代表Pluronic L64，P代表PEI，D代表pDNA。通過(guò)對(duì)不同氮磷比(N/P)的L/P/D體系介導(dǎo)的基因表達(dá)效率及體內(nèi)生物安全性評(píng)估，揭示了N/P與肌肉內(nèi)基因轉(zhuǎn)染效率的關(guān)系，并確立了PEI在骨骼肌內(nèi)應(yīng)用的有效方案。該方案為篩選和開(kāi)發(fā)高效的、適用于臨床治療的骨骼肌原位基因傳遞系統(tǒng)提供了適當(dāng)?shù)脑砗筒呗浴?/p>

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5～7周齡體質(zhì)量為20～25 g的BALB/c雄性小鼠若干，購(gòu)于成都達(dá)碩生物科技有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(川)2015-030]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在四川大學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可下進(jìn)行，符合相關(guān)法規(guī)及制度[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2013-017]。將小鼠在21 ℃、濕度45%～65%的環(huán)境中隨機(jī)分籠飼養(yǎng)。每組6只，所有小鼠均注射雙側(cè)小腿脛骨前肌。

1.2 試劑及儀器

支化聚乙烯亞胺25 kDa、Pluronic L64(Sigma-Aldrich，美國(guó))；β-半乳糖苷酶(pCMV-LacZ)原位染色試劑盒(碧云天，中國(guó))；E.Z.N.A.TM質(zhì)粒小量提取試劑盒、PureLinkTM高純質(zhì)粒大量提取試劑盒(Invitrogen，美國(guó))；Luciferase Assay Kit(Promega，美國(guó))；BCA蛋白分析試劑盒(Thermo，美國(guó))。編碼β-半乳糖苷酶、熒光素酶(pCMV-Luc)和遠(yuǎn)紅外熒光蛋白(pCMV-E2)的3種質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室劉益麗博士提供。ChemiDocTM XRS+凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))；NanoS ZEN 1600型納米粒度及電位分析儀(Malven，英國(guó))；NanoDrop 2000(Thermo，美國(guó))；MFP-3D-BIOTM原子力顯微鏡(Bruker，美國(guó))；In-VivoImaging System(CRI，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1質(zhì)粒的制備與鑒定所有質(zhì)粒在大腸桿菌EscherichiacoliDH5α中轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，并用上述提及的質(zhì)粒提取試劑盒提取獲得。制備好的質(zhì)粒用NanoDrop 2000測(cè)定濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，于-20 ℃短期保存，-80 ℃長(zhǎng)期保存。

1.3.2肌肉原位注射操作配制各實(shí)驗(yàn)組樣品，濃度為2 mg·mL-1的pDNA溶液與等濃度的PEI工作液按相應(yīng)N/P混合，其中，DNA總質(zhì)量為10 μg，室溫孵育20 min后形成N/P分別為0.5、3和10的PEI/pDNA復(fù)合物。隨后，取不同比例的復(fù)合物與10 μL 0.4%(W/V)Pluronic L64混合，用生理鹽水稀釋到40 μL，Pluronic L64終濃度為0.1%(W/V)，混合物室溫靜置5 min，形成L/P/D體系(L/P/D-0.5、L/P/D-3、L/P/D-10)，其中，L/P/D-0.5組代表PEI與pDNA的N/P=0.5，L/P/D-3組為N/P=3，L/P/D-10組為N/P=10。以生理鹽水組為陰性對(duì)照組，pDNA組為陽(yáng)性對(duì)照組1，Pluronic L64/pDNA混合液(L/D)組為陽(yáng)性對(duì)照組2。

小鼠7 d適應(yīng)期后，其兩側(cè)脛骨前肌均被脫毛、消毒。用注射器分別吸取40 μL對(duì)照組溶液和實(shí)驗(yàn)組溶液。肌肉注射時(shí)沿平行肌纖維方向進(jìn)針約2 mm，2～5 s完成注射。

1.3.3報(bào)告基因檢測(cè)采用3種報(bào)告基因檢測(cè)體系分別從定性、定量以及基因表達(dá)持續(xù)性評(píng)估L/P/D體系：

(1)β-半乳糖苷酶定性檢測(cè)：對(duì)組織以原位染色的方式進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)觀察著色范圍和顏色深淺判斷基因表達(dá)情況。按照β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包括在冰上于染色固定液中固定20 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，固定的樣本進(jìn)行染色處理2 h以上，最后用數(shù)碼照相機(jī)采集圖像。

(2)熒光素酶定量檢測(cè)：采用Luciferase Reporter Assay Kit試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟包括：樣品經(jīng)冰上勻漿、-80 ℃過(guò)夜裂解及4 ℃ 12 000 r·min-1離心3 min后，取20 μL上清液于不透光白色96孔酶標(biāo)板中，用多功能酶標(biāo)儀自動(dòng)加樣并讀取吸光值。同時(shí)，采用BCA Protein Assay Kit進(jìn)行樣品含量測(cè)定和均一化處理。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品用酶標(biāo)儀測(cè)定OD562下的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量，使用相對(duì)熒光素酶活性(RLU/mg Protein)表示結(jié)果。

(3)遠(yuǎn)紅外熒光蛋白檢測(cè)基因持續(xù)表達(dá)情況：采用活體成像系統(tǒng)對(duì)肌肉原位注射后第7、14天后的紅色熒光蛋白E2-Crimson表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)前小鼠脛骨前肌脫毛處理，用黃光激發(fā)，在600～700 nm處掃描熒光信號(hào)，最后用儀器自帶軟件進(jìn)行熒光成像分析。

1.3.4組織病理學(xué)檢測(cè)對(duì)注射后的肌肉組織和主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)切片進(jìn)行染色及觀察，評(píng)估陽(yáng)離子與Pluronic聯(lián)用的基因傳遞體系的生物安全性，為臨床使用提供依據(jù)。肌肉注射7 d后分離小腿脛骨前肌或尾靜脈注射4 d后解剖取出小鼠主要臟器，用PBS洗滌后放入4%(W/V)多聚甲醛固定液中固定48 h后，在乙醇和二甲苯溶液中進(jìn)行梯度脫水。脫水后的樣品經(jīng)過(guò)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色處理后，用光學(xué)顯微鏡拍照。

1.3.5L/P/D-0.5體系中PEI/pDNA復(fù)合物的粒徑、電位及形貌表征3 μg或20 μg pDNA與濃度為100 ng·μL-1PEI工作液按相應(yīng)N/P混合，室溫孵育20 min后用MilliQ水稀釋到1 mL。將裝有1 mL樣本溶液的1 cm石英比色皿放入馬爾文納米粒度及電位分析儀(Zeta-sizer，Malvern)中，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法(dynamic light scattering，DLS)對(duì)N/P為0.5時(shí)PEI/pDNA復(fù)合物的粒徑、分散性以及表面電位進(jìn)行檢測(cè)，樣品DNA終濃度為3 μg·mL-1，每個(gè)樣品重復(fù)3次。將復(fù)合物吸附于云母片上并干燥后，使用原子力顯微鏡(AFM)表征其粒徑和形態(tài)學(xué)特征，樣品DNA終濃度為20 μg·mL-1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Origin、Prism5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用組間單因素方差(One-Way ANOVA)或t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-半乳糖苷酶定性和熒光素酶定量分析

考察不同比例L/P/D體系對(duì)基因表達(dá)效率的影響，是應(yīng)用陽(yáng)離子材料構(gòu)建高效的骨骼肌原位基因傳遞體系的關(guān)鍵。肌肉注射7 d后，在β-半乳糖苷酶(圖1：A)和熒光素酶(圖1：B)的表達(dá)水平上，L/P/D-0.5組的基因表達(dá)水平明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組1和陽(yáng)性對(duì)照組2。然而，隨著N/P增加(L/P/D-3和L/P/D-10)，基因表達(dá)量開(kāi)始明顯下降。從數(shù)值上看，L/P/D-0.5組介導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照組1的28.6倍、陽(yáng)性對(duì)照組2的2.5倍。然而，當(dāng)N/P增加到3和10時(shí)，幾乎檢測(cè)不到外源基因的表達(dá)，相比于其他組其數(shù)值減少了至少4個(gè)數(shù)量級(jí)。這些結(jié)果說(shuō)明，只有在特定低的N/P時(shí)，PEI才能對(duì)該體系中的基因傳遞和表達(dá)產(chǎn)生積極的影響。因此，L/P/D-0.5為最優(yōu)化的L/P/D體系。

2.2 熒光蛋白基因表達(dá)情況

在動(dòng)物活體內(nèi)持續(xù)考察外源基因表達(dá)，對(duì)于評(píng)估基因表達(dá)強(qiáng)度和持續(xù)性更有說(shuō)服力(Puetal.，2014)?；铙w成像的結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組1和L/P/D-0.5組的熒光信號(hào)能持續(xù)表達(dá)至少2周且未出現(xiàn)明顯衰減。L/P/D-0.5組的熒光信號(hào)明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組1 (圖2)。

2.3 組織學(xué)分析

肌肉注射7 d后，L/P/D-0.5組與陰性對(duì)照組的HE染色切片均未發(fā)現(xiàn)組織病變(圖3：a、b)，說(shuō)明少量的PEI用于骨骼肌原位基因傳遞體系中是安全的。隨著N/P增加，L/P/D-3組顯示出肌纖維變性及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化(圖3：c)。當(dāng)N/P達(dá)到10時(shí)，HE染色切片中出現(xiàn)大面積的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和肌纖維壞死等病理變化(圖3：d)。

圖1 L/P/D體系中肌肉內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)水平Fig. 1 Intramuscular expression of reporter genes in L/P/D system

肌肉注射7 d后， A.β-半乳糖苷酶表達(dá)， B. 熒光素酶活性； a. 陽(yáng)性對(duì)照組1， b. 陽(yáng)性對(duì)照組2， c. L/P/D-0.5組， d. L/P/D-3組，e. L/P/D-10組； 與陽(yáng)性對(duì)照組1比較，*P<0.05

7 days after intramuscular injection， A. the image ofβ-galactosidase expression， B. the luciferase activity； a. positive control group 1， b. positive control group 2， c. L/P/D-0.5 group， d. L/P/D-3 group， e. L/P/D-10 group； compared with positive control group 1，*P<0.05

圖2 活體內(nèi)原位熒光蛋白表達(dá)
Fig. 2Invivoexpression of thein-situfluorescent protein

尾靜脈注射4 d后，通過(guò)觀察主要臟器的組織切片，評(píng)估該體系的體內(nèi)急性毒性。L/P/D-0.5組與陰性對(duì)照組的結(jié)果一致，未出現(xiàn)明顯的器官損傷(圖4)，說(shuō)明與局部注射的結(jié)果一致，尾靜脈注射L/P/D-0.5不會(huì)造成臟器病變，進(jìn)一步說(shuō)明該體系具有良好的生物相容性。

圖3 不同比例的L/P/D體系中局部肌肉的組織學(xué)分析(蘇木精-伊紅染色，標(biāo)尺=100 μm)Fig. 3 Histological analysis of local muscles in L/P/D systems with different N/P ratios (hematoxylin-eosin staining， scale bars=100 μm)

a. 陰性對(duì)照組， b. L/P/D-0.5組， c. L/P/D-3組， d. L/P/D-10組； 黃色箭頭為炎癥浸潤(rùn)

a. negative control group， b. L/P/D-0.5 group， C. L/P/D-3 group， D. L/P/d-10 group； the yellow arrow shows inflammatory infiltration

2.4 L/P/D-0.5體系中復(fù)合物的表征

N/P為0.5的PEI/pDNA復(fù)合物(PEI/pDNA-0.5)的粒徑見(jiàn)圖5：A，該比例復(fù)合物具有納米尺寸[304 nm±7.6 nm，多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)=0.43]，且zeta電位為負(fù)(-15.9 eV±1.4 eV)，表明當(dāng)N/P為0.5時(shí)，PEI與pDNA形成了納米尺寸的復(fù)合物粒子。通過(guò)AFM表征復(fù)合物的形貌特征，結(jié)果顯示，PEI/pDNA-0.5復(fù)合物具有近似球體的三維結(jié)構(gòu)(圖5：B、C)。而AFM測(cè)定的粒徑結(jié)果顯示該復(fù)合物的粒徑在100～200 nm，這和動(dòng)態(tài)光散射法的結(jié)果存在一定差異。

圖4 主要臟器的組織學(xué)分析(蘇木精-伊紅染色，標(biāo)尺=100 μm)Fig. 4 Histological analysis of major organs (hematoxylin-eosin staining， scale bar=100 μm)

圖5 PEI/pDNA-0.5復(fù)合物的粒徑(A)和形貌特征(B、C)Fig. 5 Size (A) and morphologies (B， C) analysis of PEI/pDNA at N/P=0.5

A. 利用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)試的納米粒子粒徑及多分散性； B. 原子力顯微鏡(AFM)對(duì)納米粒子的形貌測(cè)試結(jié)果， 右側(cè)灰度靶表示粒子的高度； C. 利用AFM測(cè)試的納米粒子立體形貌圖

A. the particle size and polydispersity index of nanoparticles tested by dynamic light scattering instrument， B. the test results of atomic force microscope (AFM) on the morphology of nanoparticles， C. the three-dimensional morphology of nanoparticles tested by AFM

3 討論

骨骼肌原位基因傳遞和表達(dá)體系為基因治療提供了理想的策略，該體系的開(kāi)放性允許將多種方法聯(lián)合應(yīng)用，以獲得更好的治療效果。非離子型材料Pluronic可以提高基因傳遞效率，主要用于：(1)和病毒載體聯(lián)用以提高其安全性并增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染效率(Feldmanetal.，1997；Dishartetal.，2003)；(2)作為載體修飾基團(tuán)(Jeonetal.，2003)或輔劑(Astafievaetal.，1996)改善陽(yáng)離子非病毒載體在血清/生理環(huán)境中的穩(wěn)定性并提高基因轉(zhuǎn)染效率；(3)單獨(dú)或與物理方法聯(lián)用，能顯著增強(qiáng)外源基因在肌肉原位基因傳遞體系中的傳遞/表達(dá)水平(Guérin，2000；Songetal.，2013；Liuetal.，2014)。Pluronic可能通過(guò)多種分子機(jī)制促進(jìn)外源基因傳遞和表達(dá)，譬如，通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性以增強(qiáng)pDNA、病毒載體或陽(yáng)離子材料/DNA復(fù)合物的攝取(Gebhartetal.，2002)；促進(jìn)pDNA在骨骼肌中的滲透、分布或入核作用等(Guérin，2000；Pitardetal.，2002)。在一種Pluronic L64介導(dǎo)的高效的骨骼肌內(nèi)基因傳遞方案中，Pluronic L64利用相似的磷脂分子層結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜相互作用，干擾其完整性，提高膜滲透性(Liuetal.，2014)。然而在該體系中，由于其Pluronic L64不與pDNA相互作用，未受保護(hù)的DNA在復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中容易被核酸酶降解，難以順利、安全傳遞到目標(biāo)位點(diǎn)(Schmidtwolf & Schmidtwolf，2003)。與此同時(shí)，相比于被壓縮成納米級(jí)的核酸分子，未被壓縮的pDNA由于疏松的分子鏈狀態(tài)，其跨膜運(yùn)動(dòng)的效率會(huì)降低(Godbeyetal.，1999)。

一種常見(jiàn)的核酸保護(hù)策略是利用陽(yáng)離子載體通過(guò)電荷作用對(duì)帶負(fù)電荷的核酸分子進(jìn)行壓縮保護(hù)。支化聚乙烯亞胺作為一種公認(rèn)的核酸載體被廣泛應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)染，展示出優(yōu)異的轉(zhuǎn)染效果(Xuetal.，2009；Heetal.，2013)。然而，大多數(shù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)卻揭示了陽(yáng)離子材料對(duì)肌內(nèi)基因傳遞和表達(dá)的無(wú)效性甚至強(qiáng)烈的抑制作用(Trosetal.，2010；Songetal.，2013；Puetal.，2014)。這可能是由于體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境和復(fù)雜體內(nèi)肌肉環(huán)境的不同所造成的(Ruponenetal.，1999)。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中大量帶負(fù)電荷的分子能結(jié)合帶正電荷的PEI/pDNA復(fù)合體，從而干擾復(fù)合物向肌肉細(xì)胞內(nèi)的傳遞，極大地降低了肌內(nèi)基因傳遞效率并引發(fā)嚴(yán)重的組織炎癥(Pitardetal.，2004；Burke & Pum，2008)。因此推測(cè)，帶負(fù)電荷或電中性的材料/pDNA復(fù)合物能避免與ECM中電負(fù)性分子的非特異性結(jié)合，可能適合于肌內(nèi)基因傳遞體系。在PEI與pDNA的復(fù)合體系中，通過(guò)調(diào)節(jié)陽(yáng)離子PEI與pDNA的比例，制備出帶有不同表面電荷的復(fù)合物。因此，本研究希望找到一個(gè)合適的PEI與pDNAs的比例，使之形成整體帶負(fù)電荷的復(fù)合物，從而避免與ECM中帶負(fù)電荷分子的相互作用，同時(shí)，降低PEI用量也可以減輕甚至避免局部炎癥反應(yīng)等，這些都可能有利于目的基因向肌肉細(xì)胞中的傳遞和表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，只有L/P/D-0.5組可以明顯提升外源基因表達(dá)水平，并能在監(jiān)測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)維持高水平表達(dá)，當(dāng)N/P增加，L/P/D介導(dǎo)的基因表達(dá)急劇下降，甚至低于陽(yáng)性對(duì)照組1。同時(shí)，無(wú)論是肌肉原位注射還是尾靜脈注射，L/P/D-0.5均表現(xiàn)出很好的生物相容性，能夠安全適用于骨骼肌基因傳遞以增強(qiáng)外源基因的表達(dá)水平，而提高N/P肌肉組織會(huì)有不同程度的病理變化，特別是高N/P時(shí)(N/P=10)。上述基因表達(dá)水平和生物安全性的數(shù)據(jù)與預(yù)期結(jié)果一致，證明在特定的低比例條件下，PEI/pDNA復(fù)合物的電負(fù)性特征的確有助于構(gòu)建高效安全的骨骼肌原位基因傳遞/表達(dá)體系。值得一提的是，這個(gè)比例在體外基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中完全無(wú)效，體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，N/P在10～15為最佳轉(zhuǎn)染條件。這也表明了體內(nèi)外基因傳遞所需條件截然不同，這可能與體內(nèi)外細(xì)胞所處環(huán)境不同有關(guān)。

由于PEI完全壓縮DNA時(shí)的N/P為3(Daietal.，2011；Dai & Wu，2012)，因此，N/P為0.5時(shí)，復(fù)合物中的DNA并不能被完全壓縮，但少量PEI的加入已使DNA的結(jié)構(gòu)變得相對(duì)緊密，形成了具有一定三維形態(tài)且?guī)ж?fù)電荷的納米復(fù)合物。雖然由2種檢測(cè)手段檢測(cè)出的復(fù)合物粒徑有所差異，其誤差可能是不同的制樣條件導(dǎo)致的。AFM圖像反映的是干燥后的納米粒子的三維結(jié)構(gòu)，而DLS則需要納米粒子在溶液狀態(tài)時(shí)測(cè)定(Lietal.，2001)。我們推測(cè)，在L/P/D-0.5體系中，PEI/pDNA復(fù)合物的電負(fù)性特征使其免于被滯留于ECM中，有利于其向細(xì)胞內(nèi)的傳遞；兩親性Pluronic L64分子利用其與細(xì)胞膜的相似性而擾動(dòng)并提高細(xì)胞膜的通透性(Chenetal.，2015)，為復(fù)合物分子進(jìn)入細(xì)胞創(chuàng)造了有利條件；PEI壓縮pDNA形成了結(jié)構(gòu)較為緊密的復(fù)合物分子，更有利于其穿過(guò)通透性增高的細(xì)胞膜，并抵御了核酸酶的降解。這些條件使L/P/D-0.5體系的傳遞和表達(dá)效率超過(guò)了質(zhì)粒和單純Pluronic L64介導(dǎo)的體系，達(dá)到了一個(gè)新的高度。

本研究以BALB/c小鼠為模型，驗(yàn)證了一個(gè)重要概念：將pDNA壓縮成帶負(fù)電荷的納米復(fù)合物粒子，能夠應(yīng)用于并提高Pluronic L64介導(dǎo)的骨骼肌原位基因傳遞和表達(dá)水平。這一概念的驗(yàn)證，為如何促進(jìn)DNA/材料復(fù)合物分子進(jìn)入骨骼肌細(xì)胞提供了一個(gè)解決之道，對(duì)構(gòu)建更加高效的原位基因傳遞/表達(dá)體系將產(chǎn)生推動(dòng)作用，由此可以設(shè)計(jì)更合適的材料分子壓縮DNA，進(jìn)一步提高外源基因表達(dá)水平，甚至可能將該體系推進(jìn)到應(yīng)用水平。事實(shí)上，在本項(xiàng)研究中，一次性肌注后，紅色熒光蛋白在小鼠骨骼肌細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定的高表達(dá)，已經(jīng)展示了該體系對(duì)一些長(zhǎng)期、慢性病變的應(yīng)用前景。