古淑青, 詹麗娜, 趙超敏, 鄭 江, 蔡一村, 鄧曉軍*

(1. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 上海 200135; 2. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品工程系, 上海 200436)

近年來(lái),隨著肉類(lèi)價(jià)格差異不斷擴(kuò)大,不法商家為了追求利益,以次充好、摻雜摻假的現(xiàn)象層出不窮。羊肉作為一種溫補(bǔ)食品,深受消費(fèi)者喜愛(ài)。但由于其價(jià)格較高,且羊肉串、羊肉卷、羊肉干等加工制品種類(lèi)較多,不法分子常用價(jià)格較為低廉的豬肉、雞肉或鴨肉來(lái)偽造羊肉制品。這不僅侵害了消費(fèi)者的權(quán)益,還涉及宗教信仰問(wèn)題,容易引發(fā)社會(huì)的不安定因素。因此,建立準(zhǔn)確、可靠、靈敏的羊肉中外源肉的摻假鑒別方法具有重要意義。

目前,肉類(lèi)的摻假鑒別方法主要有酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)和新近興起的質(zhì)譜確證技術(shù)[1,2]。其中,ELISA和PCR是常規(guī)檢測(cè)方法,發(fā)展較為成熟。但是ELISA方法一次只能檢測(cè)一個(gè)目標(biāo)物,效率較低,并且在鑒別相近物種的肉類(lèi)時(shí),對(duì)于結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)容易出現(xiàn)交叉反應(yīng);PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè),但其檢測(cè)物DNA在高度加工或者頻繁處理的肉類(lèi)樣品中容易降解。質(zhì)譜技術(shù)主要檢測(cè)蛋白質(zhì)和/或多肽,穩(wěn)定性強(qiáng),靈敏度高,可以實(shí)現(xiàn)多物種的同時(shí)測(cè)定,并且能夠?qū)ξ锓N的特征蛋白質(zhì)和多肽進(jìn)行明確鑒定[3]。

早期基于質(zhì)譜的肉類(lèi)鑒別工作主要利用凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離,用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定[4,5],該方法操作繁瑣費(fèi)時(shí),不利于高通量分析。隨著靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,基于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的物種特異肽段檢測(cè)已逐漸成為肉類(lèi)摻假鑒別的主要方法。Kim等[6]采用質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了生牛肉、豬肉和家禽肉的鑒別和不同物種間特征肽段的選擇。周廣運(yùn)等[7]采用高分辨質(zhì)譜結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)分析鑒定了豬肉中8種潛在的特征肽段。Marbaix等[8]實(shí)現(xiàn)了加工肉制品中牛肉、豬肉和羊肉特征肽段的確證。Sarah等[9]利用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC-QTOF-MS)鑒別出了豬肉、牛肉、山羊肉和雞肉的潛在特征肽段。但同時(shí)確定羊肉、鴨肉、雞肉和豬肉4種肉類(lèi)的生物標(biāo)志性特征肽段并對(duì)羊肉中鴨肉、雞肉和豬肉摻假的定量研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本文采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q/Exactive-HRMS)和超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-QqQ-MS)相結(jié)合,篩選出羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉4種肉類(lèi)的20個(gè)特征肽段,并且建立了以特征肽段為分析對(duì)象的羊肉摻假鑒別和定量測(cè)定方法,為肉類(lèi)摻假檢測(cè)提供了有力的技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(Q-Exactive,美國(guó)Thermo Fisher公司); Nexera X2液相色譜(日本Shimadzu公司), QTrap 6500三重四極桿-線(xiàn)性離子阱復(fù)合質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)AB Sciex公司);離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司);水浴鍋(德國(guó)Julabo公司);高速振蕩機(jī)(日本Eyela公司);氮吹儀(美國(guó)Jnc公司)。所有實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制得。

碳酸氫銨(純度≥99.5%)、尿素(純度≥99.0%)、硫脲(純度≥99.0%)、二硫蘇糖醇(DDT,純度≥99.5%)、碘代乙酰胺(IAA,純度≥99.0%)、二水氯化鈣(純度≥99.0%)(美國(guó)Sigma公司);牛胰蛋白酶(sequencing grade,美國(guó)Promega公司); Tris-HCl緩沖液、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司); RapiGest SF Surfactant和Oasis HLB固相萃取小柱(1 mL/30 mg, 30 μm)(美國(guó)Waters公司); SPE固相萃取柱(Strata-X 33u,德國(guó)Phenomenex公司);甲酸(色譜純,美國(guó)Fluka公司);乙腈(色譜純,美國(guó)Thermo Fisher公司);超濾離心管(1.5 mL)和正己烷(色譜純)(中國(guó)Anpel公司);丙酮(色譜純,德國(guó)CNW公司);低蛋白吸附離心管(1.5 mL,德國(guó)Eppendorf公司);低蛋白吸附移液器吸頭(0.1 mL/1.0 mL,德國(guó)Brand公司)。雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉和羊肉樣品均為市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1蛋白質(zhì)提取

取1 g絞碎后的肉類(lèi)樣品(去除可見(jiàn)的脂肪組織和結(jié)締組織,無(wú)特殊部位要求)于50 mL離心管中,加5 mL正己烷,超聲3 min,渦旋震蕩5 min,以4 500 r/min的速度離心3 min,去除上清液。以上步驟重復(fù)兩次后,用氮?dú)獯蹈蓸悠?。加?0 mL提取液(尿素6 mol/L,硫脲2 mol/L, Tris-HCl 50 mmol/L, pH=8.0±0.2),振蕩5 min,將肉中的結(jié)締組織打散。以4 500 r/min的速度離心3 min后取上清,再以12 000 r/min的速度于4 ℃離心5 min。采用Bradford試劑盒測(cè)定上清液蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2蛋白質(zhì)酶解

蛋白質(zhì)酶解步驟與文獻(xiàn)報(bào)道相似[10,11]。取100 μL上清,用水稀釋至1 mL后,取200 μL(蛋白質(zhì)含量約300 μg)放入1.5 mL離心管中,加入終濃度為0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的RapiGest SF Surfactant,混勻。隨后加入150 μL 500 mmol/L碳酸氫銨,混勻后加入10 μL 500 mmol/L DDT溶液,于75 ℃下恒溫反應(yīng)30 min。冷卻至室溫后加入30 μL 500 mmol/L的IAA溶液,暗處?kù)o置30 min。隨后加入10 μL 100 mmol/L氯化鈣溶液和50 μL 500 mg/L牛胰蛋白酶溶液,混勻后置于37 ℃恒溫水浴中酶解2 h。加入20 μL甲酸終止反應(yīng),室溫放置15 min,加水定容至1 mL。

1.2.3肽段純化

首先采用1 mL甲醇、1 mL 1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸-水溶液進(jìn)行活化及平衡Oasis HLB小柱,然后加入1 mL酶解后的樣品,分別采用含5%甲醇和1%甲酸的水溶液進(jìn)行清洗,最后采用1 mL 1%甲酸-乙腈溶液分兩次進(jìn)行洗脫。洗脫后的溶液用氮?dú)獯蹈?用500 μL含0.1%甲酸的乙腈-水(3∶97, v/v)溶液溶解后用質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.4UPLC-Q/Orbitrap-HRMS條件

色譜條件:采用Kinetex XB-C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國(guó)Phenomenex),流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-水溶液,流動(dòng)相B為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-乙腈溶液。液相梯度洗脫程序:0～4 min, 97%A; 4～19 min, 97%A～30%A; 19～20 min, 30%A～10%A; 20～24 min, 10%A; 24～25 min, 10%A～97%A; 25～30 min, 97%A。流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;柱溫:35 ℃。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離(ESI)源,采用正離子模式;保護(hù)氣壓力:206.85 kPa;輔助氣壓力:68.95 kPa;噴嘴電壓:3.5 kV;毛細(xì)管溫度:320 ℃;輔助氣溫度:250 ℃;全掃描模式;掃描范圍:m/z300～2 000;分辨率:35 000。

1.2.5UPLC-QqQ-MS條件

色譜條件:采用上述相同色譜柱,流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-水溶液,流動(dòng)相B為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-乙腈溶液。液相梯度洗脫程序:0～3 min, 97%A; 3～10 min, 97%A～70%A; 10～13 min, 70%A～20%A; 13～16 min, 20%A; 16～20 min, 97%A。流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣體積:5 μL;柱溫:35 ℃。

質(zhì)譜條件:ESI源,采用正離子模式;氣簾氣壓力:241 kPa;噴嘴電壓:5.5 kV;毛細(xì)管溫度:500 ℃;離子源氣體1:379 kPa;離子源氣體2:345 kPa;碰撞氣壓力:medium。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1酶解條件優(yōu)化

常規(guī)的酶解反應(yīng)往往需要12 h以上,工作效率低,且易引發(fā)副反應(yīng)[12]。RapiGest SF Surfactant是一種表面活性劑,可使蛋白質(zhì)變性,低濃度時(shí)對(duì)胰蛋白酶活性無(wú)抑制,且不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)造成副反應(yīng)化學(xué)修飾[13,14]。本試驗(yàn)考察了RapiGest SF Surfactant在提高肉類(lèi)蛋白質(zhì)酶解效率中的作用。樣品中加入終濃度為0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的RapiGest SF Surfactant,分別酶解0.5、1、2、3.5、5 h和過(guò)夜(約18 h),經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè),記錄特征肽段提取離子流色譜圖峰面積。結(jié)果表明,羊肉的酶解時(shí)間為2 h時(shí),各肽段的檢測(cè)濃度即可達(dá)到最高值。與通常需過(guò)夜反應(yīng)相比,使用RapiGest SF Surfactant大大縮短了酶解時(shí)間,提高了實(shí)驗(yàn)效率,并且操作簡(jiǎn)單,酶解后只需酸化即可促使其分解,適用于質(zhì)譜分析。

2.1.2固相萃取條件優(yōu)化

為提高檢測(cè)靈敏度并增強(qiáng)系統(tǒng)穩(wěn)定性,需要在質(zhì)譜檢測(cè)前除去樣品中多余的酶解試劑、鹽類(lèi)及其他成分。本試驗(yàn)在相同條件下比較了兩種固相萃取小柱Strata-X SPE[15,16]和Oasis HLB[17]的除雜效果。依次用1 mL甲醇、1 mL 1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸-水溶液活化及平衡小柱,加入酶解后的樣品,優(yōu)化淋洗和洗脫條件,收集洗脫液,用質(zhì)譜檢測(cè)各特征肽段的峰面積。分別考察了甲醇體積分?jǐn)?shù)為0、2.5%、5%、10%、20%、40%和60%的1%甲酸-水溶液的淋洗效果,最終選擇含5%甲醇的1%甲酸-水溶液為淋洗液。采用1%甲酸-乙腈溶液進(jìn)行洗脫,每1 mL洗脫液收集1次,并測(cè)定回收率,繪制洗脫曲線(xiàn),結(jié)果表明,采用1 mL 1%甲酸-乙腈溶液分兩次洗脫效果最佳。洗脫后的溶液用氮?dú)獯蹈?用500 μL含0.1%甲酸的乙腈-水(3∶97, v/v)溶液溶解后進(jìn)質(zhì)譜檢測(cè)。結(jié)果如表1所示,選用Oasis HLB小柱可以獲得更佳的回收率和精密度(RSD),因此選擇Oasis HLB小柱純化酶解后的多肽樣品。

表 1 固相萃取純化后4種肉類(lèi)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

圖 1 羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉(從上至下)的肌紅蛋白氨基酸序列圖

2.2 特征肽段的選擇

同小分子物質(zhì)的檢測(cè)類(lèi)似,在蛋白質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域,MRM方法也被公認(rèn)為是靈敏度最高的檢測(cè)方法,在食品靶向蛋白質(zhì)組學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。而建立靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的第一步也是最重要的一步就是確定合適的特征肽段[10]。特征肽段指某一個(gè)蛋白質(zhì)所特有的能夠?qū)⑵渑c其他蛋白質(zhì)特異性區(qū)分的肽段序列。特征肽段的選擇應(yīng)遵循以下原則[11]:為一段高保守的氨基酸序列,不易發(fā)生修飾影響定量;易被質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè),且具有響應(yīng)較強(qiáng)的碎片離子;非常穩(wěn)定,不含易脫氨的Asp-Gly、易環(huán)化的N端Gln等;不會(huì)發(fā)生錯(cuò)切或漏切,酶解具有較高的重現(xiàn)性;8～25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽為優(yōu)先選擇。

在本工作中,特征肽段的選擇主要分為5步:1.利用UPLC-Q/Exactive-HRMS高分辨質(zhì)譜平臺(tái)對(duì)酶解后的樣品進(jìn)行Full MS/dd-MS2(Data-dependent MS2)掃描,得到包含一級(jí)質(zhì)譜(MS)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)的數(shù)據(jù)。2.利用ProteinPilot(Version 5.0, AB SCIEX)蛋白質(zhì)搜索軟件結(jié)合uniprot數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,包括氨基酸序列的覆蓋率(與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的氨基酸占總氨基酸的比例)和肽段碎片的匹配度驗(yàn)證,并且將滿(mǎn)足上述選擇原則的肽段標(biāo)記為備選特征肽段。3.將備選特征肽段通過(guò)BLAST(http://www.uniprot.org/blast/)搜索[18,19],驗(yàn)證其種屬的特異性,去掉非特異性肽段,保留特征肽段。4.將選擇的特征肽段同時(shí)導(dǎo)入Skyline軟件(Version 5.0),利用該軟件在UPLC-QqQ-MS平臺(tái)上建立MRM方法,自動(dòng)優(yōu)化離子對(duì)、碰撞能量和去簇電壓信息。5.選擇經(jīng)過(guò)不同加工的肉制品樣品驗(yàn)證所選的特征肽段,確保特征肽段的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

Q-Exactive的Full MS/dd-MS2掃描模式主要包括兩個(gè)連續(xù)和依賴(lài)性的掃描事件:一級(jí)質(zhì)譜MS全掃描和響應(yīng)超過(guò)一定閾值的前體離子的二級(jí)質(zhì)譜MS2掃描。使用時(shí)設(shè)置一級(jí)MS分辨率為70 000,二級(jí)MS2分辨率為17 500,歸一化碰撞能(NCE)為27%。Proteinpilot的參數(shù)設(shè)置如下:碘乙酸作為半胱氨酸修飾劑,胰蛋白酶作為消化酶,“生物修飾”作為“識(shí)別重點(diǎn)”,置信度為95%,錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR,指示確定性的確定性度量)設(shè)置為0.01。

由于肉類(lèi)肌紅蛋白(myoglobin)的氨基酸序列具有種類(lèi)特異性差異,常用于物種鑒別[2,3]。因此,試驗(yàn)中以肌紅蛋白為例,證明本方法蛋白質(zhì)和多肽鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。4種肉類(lèi)的肌紅蛋白鑒定結(jié)果如圖1所示,從上至下分別為羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉的肌紅蛋白氨基酸序列,其中彩色部分代表質(zhì)譜鑒定出來(lái)的能夠跟數(shù)據(jù)庫(kù)中序列匹配的部分,黑色代表未能明確鑒定的部分。在此條件下,獲得羊肉、鴨肉、豬肉和雞肉肌紅蛋白的氨基酸覆蓋率分別為77.3%、72.1%、71.4%和72.7%。

多肽碎片離子的二級(jí)質(zhì)譜鑒定主要考察備選的特征肽段碎片離子檢測(cè)結(jié)果與理論推測(cè)的吻和性,這是數(shù)據(jù)庫(kù)搜索打分的重要指標(biāo),同時(shí)還可以確定該肽段是否存在氨基酸修飾、分子內(nèi)反應(yīng)等。多肽在電噴霧電離中,主要產(chǎn)生N端碎片離子(b離子)和C端碎片離子(y離子)。以鴨肉肌紅蛋白的特征肽段HGVTVLTQLGK(m/z576.8)為例,如圖2所示,圖中紅色和綠色譜線(xiàn)分別代表理論b離子和y離子的碎片峰,藍(lán)色譜線(xiàn)代表實(shí)驗(yàn)獲得的離子碎片峰,可以看出實(shí)驗(yàn)獲得的譜圖和預(yù)測(cè)的碎裂模式之間有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系,20個(gè)b、y碎片離子均得到鑒定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)測(cè)的碎裂模式高度匹配并顯示了很高的置信度,證明該肽段可用于MRM進(jìn)一步分析。

圖 2 鴨肉特征肽段HGVTVLTQLGK(m/z 564.8)的碎片離子排布實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論對(duì)比圖

利用本方法篩選出羊肉的3個(gè)特征肽段,分別屬于肌紅蛋白和血紅蛋白β亞型;鴨肉的7個(gè)特征肽段,分別屬于肌紅蛋白、血紅蛋白α亞型-D和載脂蛋白A-I;豬肉的6個(gè)特征肽段,分別屬于肌紅蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶、肌球蛋白和碳酸酐酶-3;雞肉的4個(gè)特征肽段,分別屬于肌紅蛋白、肌球蛋白輕鏈-3和β-烯醇酶(見(jiàn)表2)。針對(duì)篩選出的特征肽段,在UPLC-QqQ-MS平臺(tái)上建立MRM方法,針對(duì)每個(gè)特征肽段,選擇3個(gè)干擾最少、響應(yīng)最高的子離子用于后續(xù)的定性和定量檢測(cè)。

表 2 羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉的特征肽段及MRM參數(shù)

表 2 (續(xù))

* Quantitative ion. DP: declustering potential. CE: collision energy.

表 3 鴨肉、豬肉和雞肉的9個(gè)特征肽段的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass percentage, %.

圖 3 豬肉特征肽段HPGDFGADAQGAMSK的CE和DP值優(yōu)化結(jié)果

建立MRM方法的一個(gè)目的就是為了精確定量,因此需要優(yōu)化各質(zhì)譜條件以提高檢測(cè)的靈敏度。當(dāng)使用MRM方法檢測(cè)目標(biāo)較多時(shí),逐一優(yōu)化質(zhì)譜條件往往需要耗費(fèi)大量的時(shí)間。Skyline軟件可以用來(lái)設(shè)計(jì)和改善MRM方法,優(yōu)化碰撞能量(CE)和去簇電壓(DP),提高各特征肽段的響應(yīng)強(qiáng)度。以豬肉特征肽段HPGDFGADAQGAMSK為例,對(duì)離子通路496.889 4(2+)→493.243 9(+)施加不同的CE值和DP值,所得出的響應(yīng)強(qiáng)度結(jié)果如圖3所示,當(dāng)CE為18.8 eV, DP為40 V時(shí)肽段響應(yīng)強(qiáng)度最高。如此,針對(duì)每個(gè)離子對(duì)優(yōu)化出一個(gè)最佳的CE值和DP值,生成最終的MRM定量方法。優(yōu)化后的MRM方法中各物種特征肽段離子對(duì)信息見(jiàn)表2,優(yōu)化后各物種特征肽段的提取離子色譜圖見(jiàn)圖4。

圖 4 羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉特征肽段的提取離子流色譜圖

雖然經(jīng)過(guò)BLAST搜索,確定所選肽段為該物種的特征肽段,但是由于某些物種的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)還未完善[20],為避免因數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)的缺失對(duì)物種特征肽段確認(rèn)所造成的影響,需要對(duì)所選的特征肽段進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證,確保所選肽段的特異性。驗(yàn)證方法采用排除法,以雞肉為例,將鴨肉、豬肉和羊肉特征肽段的MRM方法合并形成一個(gè)新的MRM方法,用該方法檢測(cè)雞肉樣品,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5a所示,雞肉樣品采集到的色譜質(zhì)譜圖中沒(méi)有出現(xiàn)其他3種肉類(lèi)的特征肽段峰,其中出現(xiàn)了個(gè)別肽段的單個(gè)離子對(duì)的色譜峰,但保留時(shí)間和對(duì)應(yīng)肽段并不相同,為干擾離子峰。采用相同方法檢測(cè)了鴨肉、豬肉和羊肉樣品,結(jié)果如圖5b～5d所示,未出現(xiàn)保留時(shí)間和至少兩個(gè)離子對(duì)符合的情況。說(shuō)明利用本方法篩選出的羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉特征肽段之間不存在互相干擾,能夠確保方法的專(zhuān)一性和可靠性。

圖 5 肽段特異性考察結(jié)果

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

鴨肉、豬肉、雞肉為羊肉制品中最常見(jiàn)的摻假成分,采用本方法對(duì)羊肉摻假檢測(cè)進(jìn)行了定量研究,即考察羊肉中鴨肉、豬肉和雞肉的檢出限、定量限、回收率等性能參數(shù)。針對(duì)每個(gè)物種,分別選擇響應(yīng)強(qiáng)度最高的3個(gè)特征肽段進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.3.1線(xiàn)性關(guān)系、定量限和檢出限

將鴨肉、豬肉、雞肉分別按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、5%、10%、20%、50%的比例混合在羊肉中,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如表3所示,分別以混合比例(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為橫坐標(biāo)(X,%),以所選取的鴨肉、豬肉和雞肉的特征肽段峰面積(Y)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。各標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)性系數(shù)均大于0.99。以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),最終確定鴨肉、豬肉和雞肉的最低摻假檢出限分別為0.25%、0.17%和0.10%,最低摻假定量限分別為0.83%、0.57%和0.33%。該結(jié)果優(yōu)于目前大部分文獻(xiàn)[15,16,21,22]報(bào)道的水平。在后續(xù)的工作中可引入同位素內(nèi)標(biāo),用以抵消不同樣品的基質(zhì)效應(yīng),進(jìn)一步提高定量的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

2.3.2回收率和精密度

在羊肉中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、5%和20%的鴨肉、豬肉和雞肉,按1.2.2節(jié)步驟酶解后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量計(jì)算加標(biāo)回收。結(jié)果見(jiàn)表4,平均加標(biāo)回收率為71.4%～115.0%,日內(nèi)精密度(RSD)小于8%,日間RSD小于15%,證明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性,使用該方法能夠較可靠地測(cè)定羊肉樣品中3種摻假肉類(lèi)成分的含量。

表 4 鴨肉、豬肉和雞肉的9個(gè)特征肽段的平均回收率和日內(nèi)精密度、日間精密度

表 4 (續(xù))

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證所建立分析方法的適用性,對(duì)30份在市場(chǎng)上隨機(jī)抽取的羊肉制品(包括羊肉卷、羊肉串和羊肉干)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,本次抽樣篩查結(jié)果良好,羊肉制品中只檢測(cè)到羊肉的特征肽段,鴨肉、豬肉和雞肉的特征肽段均未檢測(cè)到。并且采用PCR方法進(jìn)行比對(duì),結(jié)果與本方法吻合,進(jìn)一步證明了所建方法的適用性。

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-Q/Exactive-HRMS和UPLC-QqQ-MS相結(jié)合,共篩選出4種肉類(lèi)的20個(gè)特征肽段,并且建立了以特征肽段為分析對(duì)象的羊肉摻假鑒別和定量測(cè)定方法。采用本方法,樣品酶解時(shí)間短,干擾少,具有較高的靈敏度和回收率?；诖嗽砜赏瑫r(shí)進(jìn)行多種肉類(lèi)的鑒別,為摻假檢測(cè)提供了一種有力的研究平臺(tái),可以同其他技術(shù)相互補(bǔ)充,在食品真?zhèn)舞b別領(lǐng)域具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。