王 浩, 邵明媛, 賈婧怡, 劉明艷, 裴 帆

(國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心, 北京 100094)

嬰幼兒配方乳粉是通過添加營養(yǎng)成分使其組成在數(shù)量上和質(zhì)量上無限接近母乳的營養(yǎng)元素為目標(biāo)的調(diào)制乳粉[1]。嬰幼兒配方乳粉消費(fèi)比例逐年增加,所以其安全問題備受關(guān)注?！按箢^娃娃”“三聚氰胺”等重大食品安全事件發(fā)生后,我國大力加強(qiáng)了嬰幼兒配方乳粉的監(jiān)管力度。全氟辛酸(PFOA)、全氟辛烷磺酸(PFOS)是最常見的兩種全氟化合物污染物,具有疏油、疏水等特性,被稱為新型持久性有機(jī)污染物,已被發(fā)現(xiàn)可分布在各類人體基質(zhì)以及多個(gè)組織器官中,對嬰幼兒的生長、發(fā)育存在嚴(yán)重影響[2]。雙酚A(BPA)和壬基酚(NP)是常見的內(nèi)分泌干擾物,可通過食物鏈進(jìn)入人體,可導(dǎo)致性早熟、免疫力下降等,對嬰幼兒正常發(fā)育的影響尤為顯著[3,4]?；谌衔锖蛢?nèi)分泌干擾物等污染物對嬰幼兒正常生長發(fā)育的危害性,雖然目前國家還未制定相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn),但相關(guān)監(jiān)管部門已將其作為風(fēng)險(xiǎn)因子進(jìn)行監(jiān)測,且規(guī)定了臨時(shí)限量值。因此,及時(shí)開發(fā)簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的嬰幼兒配方乳粉中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚殘留的檢測方法勢在必行。

目前,測定全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚殘留的方法主要有液相色譜-質(zhì)譜法[5-11]、液相色譜法[12,13]和氣相色譜-質(zhì)譜法等[14,15]。但檢測乳粉中雙酚A和壬基酚的前處理方法大都采用環(huán)己烷-乙酸乙酯提取或者乙腈直接提取,這種方式往往只能提取乳粉顆粒表面的目標(biāo)化合物,乳粉內(nèi)部的目標(biāo)化合物不能得到釋放,同時(shí)經(jīng)過陽性樣品比較,這種提取方式容易造成測定值偏低。此外,目前尚未有檢測嬰配乳粉中全氟辛酸和全氟辛烷磺酸的報(bào)道。本研究采用超聲輔助溫水溶解樣品,乙腈沉淀蛋白質(zhì),內(nèi)標(biāo)法定量,高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定。本方法前處理簡單,靈敏度高,適用于嬰幼兒配方乳粉中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚的同時(shí)快速檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Agilent 6410型三重四極桿質(zhì)譜儀,配電噴霧離子源(Agilent公司); Agilent 1200型液相色譜儀(Agilent公司); GL-88B型渦旋混合器(海門市其林貝爾公司); KQ-5200型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司); Milli-Q去離子水發(fā)生器(Millipore公司)。

甲醇、乙腈、正己烷和乙酸銨均為色譜純(德國Fisher公司);全氟辛酸、13C4-全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、1,2,3,4-13C4-全氟辛烷磺酸(純度≥99%,美國Sigma公司);雙酚A、雙酚A-d4、壬基酚、3,5,3-壬基酚-13C6(純度≥98%,德國Dr. Ehrenstorfer公司);實(shí)驗(yàn)所選用樣品為作者單位檢驗(yàn)樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:分別稱取適量的全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配成0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,該溶液在-18 ℃保存,有效期1年。

內(nèi)標(biāo)儲備液:分別稱取適量的13C4-全氟辛酸、1,2,3,4-13C4-全氟辛烷磺酸、雙酚A-d4和3,5,3-壬基酚-13C6標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配成0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,該溶液在-18 ℃保存,有效期1年。

中間濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚的質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、1.0和0.5 mg/L的中間濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,該溶液在2～8 ℃保存,有效期1個(gè)月。

中間濃度內(nèi)標(biāo)溶液:用甲醇將內(nèi)標(biāo)儲備液配制成13C4-全氟辛酸、1,2,3,4-13C4-全氟辛烷磺酸、雙酚A-d4和3,5,3-壬基酚-13C6質(zhì)量濃度分別為0.10、0.10、1.0和1.0 mg/L的中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,該溶液在2～8 ℃保存,有效期1個(gè)月。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液:稱取系列空白基質(zhì)樣品,加入25 μL的中間濃度內(nèi)標(biāo)溶液,再分別加入中間濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10、20、50、100、200 μL。其余處理同1.3節(jié)。

1.3 樣品前處理

稱取1.0 g樣品(精確至0.01 g),置于10 mL具塞比色管中,依次加入中間質(zhì)量濃度內(nèi)標(biāo)溶液25 μL和2 mL 60～70 ℃熱水,渦旋30 s后,超聲提取10 min,再加入3 mL乙腈,具塞振搖使蛋白質(zhì)沉淀,吸取1 mL上清液在4 ℃條件下15 000 r/min離心5 min，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 儀器工作條件

色譜條件如下。色譜柱:Hypersil GOLD C18(50 mm×4.6 mm, 1.9 μm);流速:0.30 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量5 μL;流動相:30 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇(10∶90, v/v)。

質(zhì)譜條件如下。離子源:電噴霧離子(ESI)源;掃描方式:負(fù)離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測;干燥氣:N2;霧化氣壓力:275.8 kPa;干燥氣溫度:325 ℃;干燥氣流速:8 L/min;汽化溫度:340 ℃。

4種目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表 1 全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ions.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

乳粉基質(zhì)復(fù)雜,富含脂肪和蛋白質(zhì),所以本方法在樣品中先加入2 mL 60～70 ℃熱水,渦旋30 s,使樣品中目標(biāo)化合物充分溶解,再加入3 mL乙腈去除樣品中蛋白質(zhì)。因?yàn)槿苫訛榄h(huán)境污染物，很多溶劑(正己烷、乙酸乙酯等)、固相萃取柱、QuEChERS填料、各種濾膜都有壬基酚殘留，所以不宜做除油處理，采用高速離心后直接進(jìn)樣。這種前處理方法簡便快速,既能充分提取樣品中的全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚殘留,又能除去樣品中的蛋白質(zhì)和脂肪。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱

為了有利于色譜峰的分離及峰形的改善,本方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、Hypersil GOLD C18色譜柱(50 mm×4.6 mm, 1.9 μm)和Agilent Extend-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Hypersil GOLD C18色譜柱(50 mm×4.6 mm, 1.9 μm)上的峰形及出峰時(shí)間較為合適,所以選擇Hypersil GOLD C18色譜柱分離目標(biāo)化合物。

2.2.2流動相

分別比較了30 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇、10 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇、水-甲醇3種體系,發(fā)現(xiàn)后兩種體系中的全氟辛酸、全氟辛烷磺酸會出現(xiàn)不同程度的峰形展寬,靈敏性降低。所以本實(shí)驗(yàn)選擇流動相為30 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇(10∶90, v/v)。同時(shí),全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚極性相差較大,首先考慮用梯度洗脫的方式實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的有效分離。但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)梯度洗脫空白溶劑中出現(xiàn)雙酚A和壬基酚假陽性情況,然而等度洗脫時(shí)假陽性消失,這很可能是液相系統(tǒng)在梯度洗脫中形成的假陽性情況,因此采用等度洗脫方式。圖1為全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖。

圖 1 全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖

2.3 線性關(guān)系及方法檢出限

最優(yōu)條件下,采用空白樣品加內(nèi)標(biāo)法配制基質(zhì)工作曲線,消除測定中的基質(zhì)效應(yīng),同時(shí)又明顯提高了定量的準(zhǔn)確性。用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)樣5 μL,測定結(jié)果經(jīng)線性回歸(y為峰面積;x為質(zhì)量濃度,μg/L)。同時(shí)用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn),所得譜圖信噪比大于3的空白基質(zhì)添加量定為檢出限,信噪比大于10的空白基質(zhì)添加量定為定量限。全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚的定量限分別為0.5、1.0、10.0和5.0 μg/kg，結(jié)果見表2。

表 2 全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)、方法定量限及檢出限

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.4 方法的回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取空白樣品6份,共3組,分別加入目標(biāo)化合物。其中第一組測試液添加水平為:全氟辛酸0.5 μg/kg,全氟辛烷磺酸1.0 μg/kg,雙酚A 10.0 μg/kg,壬基酚5.0 μg/kg;第二組測試液添加水平為:全氟辛酸1.0 μg/kg,全氟辛烷磺酸2.0 μg/kg,雙酚A 20.0 μg/kg,壬基酚10.0 μg/kg;第三組測試液添加水平為:全氟辛酸5.0 μg/kg,全氟辛烷磺酸10.0 μg/kg,雙酚A 100.0 μg/kg,壬基酚50.0 μg/kg。在最優(yōu)條件下進(jìn)行樣品前處理,結(jié)果見表3。不同水平下平均加標(biāo)回收率為86.1%～106.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.87%～9.53%(n=6)。

表 3 目標(biāo)物在空白樣品中的加標(biāo)回收率與RSD(n=6)

2.5 實(shí)際樣品檢測

采用所建立的方法對市場銷售的50種嬰幼兒營養(yǎng)乳粉進(jìn)行檢測,其中49個(gè)樣品檢出壬基酚(含量范圍為14.7～373 μg/kg,檢出率98.0%), 6個(gè)樣品檢出全氟辛酸(含量范圍為0.51～1.34 μg/kg,檢出率12.0%), 4個(gè)樣品檢出全氟辛烷磺酸(含量范圍為1.06～7.79 μg/kg,檢出率8.0%),雙酚A未檢出。其中一個(gè)陽性樣品色譜圖如圖2所示。上述結(jié)果表明,嬰幼兒營養(yǎng)乳粉中壬基酚殘留比較嚴(yán)重,同時(shí)也存在全氟辛酸和全氟辛烷磺酸殘留。

圖 2 含全氟辛烷磺酸和壬基酚的陽性樣品的MRM色譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測定嬰幼兒配方乳粉中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。本方法的樣品前處理簡單,靈敏度高,定量限及精密度均能滿足殘留檢測要求,能為我國嬰幼兒配方乳粉中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、雙酚A和壬基酚殘留的監(jiān)管與監(jiān)督提供技術(shù)支撐。