鄭艷萍 田榮 張金龍 金俊杰 蔡寶昌

摘要：目的 建立康媛顆粒HPLC指紋圖譜，同時(shí)檢測(cè)芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷4個(gè)成分的含量。方法 采用YMC-Pack-ODS-A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動(dòng)相為0.05%磷酸水-乙腈，梯度洗脫，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃。結(jié)果 10批康媛顆粒的指紋圖譜相似度較高，確定9個(gè)共有色譜峰。芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、陳皮苷含量分別在1.102～11.02 ?g（r=1）、0.201～2.01 ?g（r=0.999 5）、0.270～2.70 ?g（r=0.999 8）、0.102～1.02 ?g（r=1）范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，儀器精密度良好，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。結(jié)論 本研究建立的康媛顆粒指紋圖譜及4個(gè)成分含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠，可用于康媛顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：康媛顆粒；芍藥苷；阿魏酸；甘草苷；橙皮苷；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.021

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）12-0088-04

Abstract： Objective To establish HPLC fingerprints of Kangyuan Granules and determine the contents of peoniflorin， ferulic acid， glycyrrhizin and hesperidin. Methods The samples were separated by the chromatographic column of YMC-Pack-ODS-A C18 （250 mm × 4.6 mm， 5 ?m）. The mobile phase was acetonitrile-0.05% phosphoric acid aqueous solution and gradient elution. The flow rate was 0.6 mL/min， and the column temperature was at 30 ℃. Results The fingerprints of 10 batches of Kangyuan Granules had higher similarity and nine common chromatogram peaks were determined. The contents of peoniflorin， ferulic acid， glycyrrhizin and hesperidin were among the ranges of 1.102–11.02 ?g （r=1）， 0.201–2.01 ?g （r=0.999 5）， 0.270–2.70 ?g （r=0.999 8） and 0.102–1.02 ?g （r=1）， respectively， which showed good linear relationship with the peak area. The instrument precision was good and the sample solution was basically stable within 24 hours. Conclusion The method of Kangyuan Granules fingerprints and the content determination of four components are simple， stable， accurate and reliable， which can be used for the quality control of Kangyuan Granules.

Keywords： Kangyuan Granules； paeoniflorin； ferulic acid； glycyrrhizin； hesperidin； HPLC

康媛顆粒是由黃芪、柴胡、當(dāng)歸、白芍、甘草、陳皮等11味中藥制成的顆粒劑，具有舒肝解郁、理氣止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)功效。該方出自《太平惠民和劑局方》，方中黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)、生津養(yǎng)血，當(dāng)歸補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)燥滑腸，柴胡和解表里、疏肝升陽(yáng)，香附理氣解郁、調(diào)經(jīng)止痛。諸藥合用，對(duì)肝郁氣滯引起的胸脅脘腹脹痛、消化不良、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、寒疝腹痛、乳房脹痛具有很好的療效。

康媛顆粒目前執(zhí)行《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》（WS3-B-3988-98），該標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品檢驗(yàn)只規(guī)定了性狀、鑒別、檢查3項(xiàng)內(nèi)容，未對(duì)其主要成分進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，導(dǎo)致市場(chǎng)上該產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，影響臨床療效。因此，本研究采用中藥指紋圖譜技術(shù)[1]建立康媛顆粒HPLC指紋圖譜，同時(shí)對(duì)制劑中芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷4種成分進(jìn)行含量測(cè)定[2-3]，從而對(duì)康媛顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制，并為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20AB高效液相色譜系統(tǒng)（包括在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱），日本島津公司；BP121S電子分析天平，SARTORIUS；KQ5200DB型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

10批康媛顆粒樣品分別來(lái)自南京海昌中藥集團(tuán)（H1、H2、H3、H4、H5）和黑龍江濟(jì)仁藥業(yè)有限公司（J6、J7、J8、J9、J10）。芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)170109）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)161204）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào)161216）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)161230），含量均大于98%，南京森貝伽生物科技有限公司。色譜純乙腈，美國(guó)天地公司；石油醚、甲醇、磷酸，南京化學(xué)試劑有限公司；屈臣氏純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用YMC-Pack-ODS-A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相為0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～10%B；10～20 min，10%～15%B；20～40 min，15%～21%B；40～60 min，21%～25%B；60～80 min，25%～30%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 ?L。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取一定量的芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷對(duì)照品，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度，最終得到濃度分別為1102、201、270、102 ?g/mL的混合對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

取康媛顆粒樣品17 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密吸取40 mL石油醚溶液，超聲（功率250 W，頻率100 kHz）30 min，過(guò)濾，棄去濾液，殘?jiān)蹈?，精密加入甲醇溶?0 mL，稱定質(zhì)量，再超聲（功率250 W，頻率100 kHz）30 min，冷卻后稱定質(zhì)量，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 ?m微孔濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 指紋圖譜及含量測(cè)定方法的建立

取10批康媛顆粒樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見(jiàn)圖1。根據(jù)10批康媛顆粒指紋圖譜分析及數(shù)據(jù)計(jì)算，結(jié)果確定共有峰9個(gè)，見(jiàn)圖2。

2.4.2 線性關(guān)系考察

取“2.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品貯備液800、600、400、200、100 ?L，分別置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到不同濃度混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并以峰面積和待測(cè)組分對(duì)照品質(zhì)量進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下制備的樣品編號(hào)為H1的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，其1～9號(hào)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.35%、0.13%、0.11%、0.05%、0.06%、0.05%、0.06%、0.07%、0.09%，相對(duì)峰面積RSD分別為1.36%、0.41%、0.97%、1.93%、1.99%、1.39%、0.56%、1.26%、0.69%，表明儀器的精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下制備的樣品編號(hào)為H1的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，1～9號(hào)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.82%、0.89%、0.86%、0.64%、0.87%、0.43%、0.44%、0.34%、0.30%，峰面積RSD分別為1.40%、2.76%、2.05%、1.57%、1.93%、1.05%、1.89%、2.37%、0.40%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取編號(hào)為H1的樣品17.0 g，共6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，其主要共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.80%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.97%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn)

取“2.4.4”項(xiàng)下含量確定的康媛顆粒樣品（H1）6份，每份約8.5 g，精密稱定，精密加入與已知含量相當(dāng)?shù)纳炙庈铡⑽核?、甘草苷、橙皮苷?duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷的平均加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2～表5。

2.4.7 樣品含量測(cè)定

取康媛顆粒樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.4.8 指紋圖譜相似度分析

將10批康媛顆粒樣品HPLC色譜圖及數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A）》，使用對(duì)照品作參照，比較分析各樣品中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)。依據(jù)參照色譜峰，將各樣品色譜圖進(jìn)行自動(dòng)匹配，進(jìn)行指紋圖譜比對(duì)，對(duì)10批康媛顆粒HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似性評(píng)價(jià)。使用對(duì)照HPLC指紋圖譜生成共有色譜峰模式，計(jì)算10批康媛顆粒樣品共有色譜峰之間的相似度，結(jié)果表明，10批康媛顆粒樣品與對(duì)照指紋圖譜具有較好的相似性，說(shuō)明所建立的康媛顆粒HPLC指紋圖譜方法能夠較好地反映不同廠家及批次康媛顆粒的質(zhì)量。結(jié)果見(jiàn)表7。

3 討論

目前，康媛顆粒樣品分析多采用HPLC對(duì)其中的芍藥苷或阿魏酸等單一指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定[4-7]，但康媛顆粒中的阿魏酸等成分不穩(wěn)定，采用單一提取方法處理的樣品雜質(zhì)峰較多，分離效果不好。本試驗(yàn)采用多種提取方法處理樣品后進(jìn)行分析，結(jié)合指紋圖譜所得色譜峰，最終確定先采用石油醚進(jìn)行脫脂處理，棄去濾液，殘?jiān)么碉L(fēng)機(jī)的冷風(fēng)吹干，再使用甲醇超聲提取的方法。此方法可使康媛顆粒主要成分色譜峰達(dá)到較好的分離效果。

目前市售康媛顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，而且由于不同批次康媛顆粒的藥材來(lái)源、炮制、生產(chǎn)工藝等因素導(dǎo)致其質(zhì)量參差不齊。對(duì)康媛顆粒主要成分芍藥苷、橙皮苷的含量測(cè)定方法有薄層掃描法[8]、紫外分光光度法等。本試驗(yàn)通過(guò)中藥指紋圖譜技術(shù)對(duì)不同批次的康媛顆粒進(jìn)行相似度分析，并同時(shí)對(duì)其中的芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷4種主要成分進(jìn)行含量測(cè)定，方法學(xué)考察結(jié)果表明，本研究建立的康媛顆粒指紋圖譜及含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于康媛顆粒的質(zhì)量控制。

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