張 爍，陸仲煙，唐 琦，李化欣，張長波，劉仲齊*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所農(nóng)業(yè)環(huán)境污染修復(fù)研究中心，天津 300191；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030；3.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，南寧 530001）

鎘（Cd）是我國污染土壤中最常見的重金屬元素。Cd在植物體內(nèi)積累到一定程度后，會對光合作用、呼吸作用、營養(yǎng)元素吸收和水分平衡等生理過程產(chǎn)生負(fù)面影響，不僅抑制植物的生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致植物死亡[1-2]。水稻是Cd積累能力最強(qiáng)的大宗谷類作物，Cd既可以通過根系的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)地上部的葉片和稻米中，也可以通過葉面污染進(jìn)入葉肉細(xì)胞，在籽粒灌漿期轉(zhuǎn)運(yùn)到稻米中[3-4]。水稻積累的Cd能通過食物鏈遷移到動物和人體內(nèi)，嚴(yán)重危害動物和人體健康[5]。

隨著水稻產(chǎn)量的不斷提高，其對微量元素的需求量也在增加。葉面噴施微量元素肥料能有效提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)[6]。錳（Mn）和鋅（Zn）是水稻生長發(fā)育所必需的微量元素。Mn在維持葉綠體穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用，能刺激生長素合成，并且可作為酶的催化劑來調(diào)節(jié)酶活性[7]。在Cd污染環(huán)境中，增施Mn能顯著降低水稻根系和地上部的Cd含量，并能提升水稻細(xì)胞壁中Cd的分配比率和降低胞液中Cd的分配比率，顯著緩解Cd對水稻生長發(fā)育的抑制作用[8-9]。增施Zn也能緩解Cd對水稻的毒害作用，促進(jìn)根系發(fā)育、提高地上部生長量[10]。葉面噴施Zn可以降低稻米對Cd的積累[11-12]，提高產(chǎn)量和稻米Zn營養(yǎng)品質(zhì)，進(jìn)而改善人類Zn營養(yǎng)狀況[13-14]。

蘋果酸（MA）是將植物不同細(xì)胞器的多種代謝聯(lián)系起來的小分子有機(jī)酸，在植物生長調(diào)節(jié)、氣孔孔徑、營養(yǎng)元素平衡和有毒金屬耐性等方面起著重要作用[15-16]。植物受到Cd脅迫時(shí)，細(xì)胞中的蘋果酸積累量會顯著增加[17]，外源添加蘋果酸能顯著提高植物生長量、增加凈光合速率、減少H2O2的積累、增強(qiáng)根系活性等，進(jìn)而減輕Cd的毒害作用[15-16，18-19]。

水培試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)結(jié)果證明：Mn和Zn對水稻幼苗Cd吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特性有顯著影響[8-10]；蘋果酸和檸檬酸等對向日葵、早熟禾、高狐草的Cd含量有顯著影響[15-16]。但在田間自然條件下，這些小分子化合物對水稻生殖生長階段的Cd積累特性有何影響，尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究以植物體內(nèi)最常見的小分子酸蘋果酸和微量元素Mn、Zn為試劑，采用水稻開花末期葉面噴施的方法，對它們調(diào)控水稻生殖器官Cd積累特性的效果和機(jī)理進(jìn)行了探討，旨在為降Cd葉面調(diào)理劑的篩選和研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與地點(diǎn)

以早稻品種Y兩優(yōu)143為材料，在廣西壯族自治區(qū)河池市選擇土壤和稻米Cd含量超標(biāo)的水稻田進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)田為水稻土，其基本理化性質(zhì)為：pH 6.53，有機(jī)質(zhì)34.38 g·kg-1，全氮0.164%，全磷0.024%，全鉀 1.20%，速效鉀 84.96 mg·kg-1，速效磷 17.1 mg·kg-1，陽離子交換量 7.82 cmol·kg-1，Cd 含量 0.69 mg·kg-1，Mn含量1 157.0 mg·kg-1，Zn含量 114.1 mg·kg-1。以分析純ZnCl2、MnCl2·4H2O、L-蘋果酸為原料配制葉面調(diào)理劑。

1.2 試驗(yàn)方法

每種葉面調(diào)理劑的田間噴施面積為10.0 m2（長4.0 m，寬2.5 m）。試驗(yàn)共分1個(gè)對照組（CK）和3個(gè)處理組，通過前期試驗(yàn)確定處理液濃度，水稻齊穗開花期向葉面均勻噴施處理液1次，為保證噴施條件一致，每個(gè)小區(qū)噴施2 L處理液，處理液均由田間灌溉水配制。其中，對照組噴施2 L灌溉水，處理1組噴施10 mmol·L-1MnCl2，處理 2 組噴施 10 mmol·L-1ZnCl2，處理3組噴施5 mmol·L-1蘋果酸，每組設(shè)3次重復(fù)。水稻采用旱育秧方式，于2016年5月10日移栽。施肥方法依照水稻測土配方施肥技術(shù)，每公頃施用的氮、磷、鉀總量分別為：尿素405 kg、普鈣600 kg、氯化鉀225 kg，其中基肥占總量的64%，分蘗肥占總量的25%，穗粒肥占總量的11%。整個(gè)生育期各處理無明顯病蟲害發(fā)生。

1.3 樣品采集與處理

水稻成熟期，選取各小區(qū)中心長3.0 m、寬1.5 m處噴施較均勻的水稻，收獲稻穗及穗下節(jié)部分裝入網(wǎng)袋，自然風(fēng)干后，將籽粒磨粉，用剪刀把穗軸、穗頸和旗葉剪碎混勻，分別收集于自封袋中，以備消解。

1.4 Cd及6種水稻礦質(zhì)元素測定方法

參照Liu等的方法[5]，分別稱取0.5 g籽粒、穗軸、穗頸、旗葉樣品于消解管中，加入7 mL HNO3搖勻，室溫下靜置12 h。將消解管放入電熱消解儀ED54上進(jìn)行消解，溫度110℃，加熱2.5 h后，冷卻至室溫，再在消煮管內(nèi)加入1 mL H2O2搖勻，110℃繼續(xù)加熱1.5 h。將消解管內(nèi)的液體于170℃下趕酸至1 mL以內(nèi)。再將消解液稀釋并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶定容，用ICPMS測定樣品中Cd、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Microsoft Excel進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算、統(tǒng)計(jì)與處理。用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，新復(fù)極差法（Duncan′s）作多重比較、差異顯著性檢驗(yàn)，并用Ori?gin 8.6作圖。

轉(zhuǎn)移因子為相鄰器官間Cd含量的比值[20]：

轉(zhuǎn)移因子（TFa/b）=a器官Cd含量/b器官Cd含量

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果酸和微量元素對稻米Cd積累特性及分配比例的影響

我國的食品安全標(biāo)準(zhǔn)（GB 2762—2012）和FAO/WHO規(guī)定的稻米Cd最大限量標(biāo)準(zhǔn)分別為0.2 mg·kg-1和0.4 mg·kg-1。在土壤pH 6.53、Cd含量0.69 mg·kg-1的輕度污染農(nóng)田中，早稻品種Y兩優(yōu)143稻米中的Cd含量高達(dá)0.63 mg·kg-1，比國家限量標(biāo)準(zhǔn)高2.15倍。水稻開花期噴施蘋果酸、MnCl2和ZnCl2對水稻籽粒中的Cd含量均有顯著抑制效果，且不同處理間存在差異，降 Cd 效果依次為蘋果酸＞ZnCl2＞MnCl2（圖1）。在蘋果酸的作用下，旗葉、穗頸、穗軸和籽粒中的Cd含量大幅度下降；而Mn和Zn主要是抑制了籽粒中的Cd含量。和CK相比，MnCl2、ZnCl2和蘋果酸處理分別使籽粒Cd含量降低了23.84%、55.44%、58.86%，穗軸Cd含量分別下降19.52%、34.86%、75.77%，穗頸Cd含量分別下降20.90%、24.20%、59.84%，旗葉Cd含量分別下降29.53%、48.11%、50.71%。

圖1 水稻開花期葉面噴施蘋果酸、MnCl2、ZnCl2對水稻各器官Cd含量的影響Figure1 Effects of foliar application with malic acid，manganese and zinc at anthesis stage on Cd content in grains and other organs of rice plants

2.2 葉面噴施蘋果酸和微量元素對水稻各器官營養(yǎng)元素含量的影響

Mg、K、Ca、Mn、Fe和Zn等營養(yǎng)元素在水稻籽粒、穗軸、穗頸和旗葉中的含量差異非常明顯。Mg含量分布高低依次為旗葉最高，籽粒次之，穗軸和穗頸最低（圖2A）。K含量分布高低依次為穗頸最高，旗葉和穗軸次之，籽粒最低（圖2B）。Ca、Mn、Fe含量分布高低依次為旗葉最高，穗軸和穗頸次之，籽粒最低（圖2C至圖2E）。Zn含量在器官間的差異較小。噴施蘋果酸、MnCl2和ZnCl2對籽粒中的Mg、K、Zn含量沒有顯著影響，噴施MnCl2對籽粒中微量元素的含量無顯著影響，噴施蘋果酸使籽粒中Ca、Mn含量顯著降低，噴施ZnCl2使籽粒中Ca、Fe含量顯著升高。

噴施蘋果酸使各器官中的Mn含量均顯著下降（圖2D），穗軸、穗頸的Mg含量顯著升高，籽粒、穗軸、旗葉的Ca含量顯著降低，穗頸Fe含量顯著升高，穗軸Zn含量顯著降低。噴施MnCl2和ZnCl2對籽粒、穗軸、穗頸和旗葉中的微量元素含量的影響總體上不大，少數(shù)微量元素含量影響達(dá)到5%的顯著水平。噴施MnCl2使穗頸Mg、K含量顯著升高，穗軸Ca、Mn含量顯著升高，穗軸K含量顯著降低。噴施ZnCl2使籽粒中Ca、Fe含量顯著升高，旗葉Mn含量顯著降低。噴施ZnCl2顯著提高了各器官中的Zn含量，但噴施MnCl2和蘋果酸對各器官中的Zn含量沒有顯著影響（圖2F）。

2.3 葉面噴施蘋果酸和微量元素對水稻各器官營養(yǎng)元素轉(zhuǎn)移因子的影響

噴施蘋果酸、MnCl2和ZnCl2不僅影響各器官中必需營養(yǎng)元素的含量，也影響營養(yǎng)元素在相鄰器官間的轉(zhuǎn)移（表1）。蘋果酸處理下Cd的TF籽粒/穗軸是CK的1.7倍 ，TF穗軸/穗頸較 CK 顯 著 降 低 。ZnCl2處 理 Cd 的TF穗頸/旗葉較CK顯著提高。MnCl2對Cd的轉(zhuǎn)移因子無顯著影響。蘋果酸對Cd的轉(zhuǎn)移因子影響較大。

葉面噴施蘋果酸能促進(jìn)Mg、K、Ca、Mn、Fe、Zn從旗葉向穗頸中轉(zhuǎn)移，其中Mg和Fe的TF穗頸/旗葉與CK差異達(dá)到顯著水平，分別為CK的1.8倍和2.1倍；抑制了K、Ca、Mn、Fe、Zn從穗頸向穗軸的轉(zhuǎn)移，但對轉(zhuǎn)移因子的影響差異不顯著；促進(jìn)了K、Ca、Mn、Fe、Zn從穗軸向籽粒中轉(zhuǎn)移，其中K、Mn、Zn的 TF籽粒/穗軸顯著提高。葉面噴施MnCl2能促進(jìn)Mg、K、Mn、Fe、Zn從旗葉向穗頸中轉(zhuǎn)移，其中Mg和K的TF穗頸/旗葉與CK差異達(dá)到顯著水平，分別為CK的1.6倍和1.5倍；同時(shí)促進(jìn)了Ca、Mn、Zn從穗頸向穗軸的轉(zhuǎn)移，其中Ca從穗頸向穗軸的轉(zhuǎn)移因子顯著增加；顯著抑制K從穗頸向穗軸的轉(zhuǎn)移，顯著促進(jìn)K從穗軸向籽粒中的轉(zhuǎn)移。葉面噴施ZnCl2能促進(jìn)Mg、K、Mn、Fe從旗葉向穗頸中轉(zhuǎn)移，Mg的TF穗頸/旗葉顯著提高，Zn的TF穗頸/旗葉顯著降低；同時(shí)抑制了Mg、K、Fe在穗軸和穗頸間的轉(zhuǎn)移，顯著促進(jìn)Zn在穗軸和穗頸間的轉(zhuǎn)移，Zn的TF穗軸/穗頸為CK的4.3倍；抑制Ca、Mn、Zn從穗軸向籽粒中的轉(zhuǎn)移，其中Zn的TF籽粒/穗軸顯著降低。

蘋果酸對Cd的轉(zhuǎn)移因子影響較大，表現(xiàn)為顯著促進(jìn)Cd從穗軸向籽粒轉(zhuǎn)移，顯著抑制Cd從穗頸向穗軸的轉(zhuǎn)移，ZnCl2處理下只顯著促進(jìn)Cd從旗葉向穗頸的轉(zhuǎn)移，而MnCl2對水稻相鄰器官間的轉(zhuǎn)移因子無顯著影響。

圖2 水稻開花期葉面噴施蘋果酸、MnCl2、ZnCl2對水稻籽粒、穗軸、穗頸、旗葉營養(yǎng)元素含量的影響Figure2 Effects of foliar application with malic acid，manganese and zinc at anthesis stage on accumulation of nutrient element in rice grains，rachises，uppermost internodes and flag leaves

3 討論

水稻收獲期稻穗中60%～90%的總碳來自開花后的光合作用，其他許多儲存在營養(yǎng)體中的營養(yǎng)元素和重金屬Cd也會在籽粒發(fā)育過程中轉(zhuǎn)運(yùn)到籽粒中[21-22]。高Cd積累品種開花后葉片中的Cd輸出率和穗軸中的Cd濃度顯著高于低Cd積累品種[4，23]。因此，通過噴施葉面調(diào)理劑來抑制莖葉中Cd向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，就有可能提高旗葉、穗頸、穗軸對Cd的阻控作用，在不影響籽粒正常發(fā)育的前提下，降低稻米中的Cd含量。本研究發(fā)現(xiàn)，水稻開花期噴施ZnCl2和蘋果酸能使稻谷中Cd含量從0.63 mg·kg-1降到0.26～0.28 mg·kg-1，達(dá)到國際食品安全標(biāo)準(zhǔn)。噴施MnCl2也能降低稻米中的Cd含量，但降Cd效果不如ZnCl2和蘋果酸。不同葉面調(diào)理劑降Cd效果的差異可能與各自獨(dú)特的調(diào)控機(jī)理有關(guān)。微量元素Mn和Zn可能主要通過拮抗作用來抑制Cd從營養(yǎng)器官向稻米中的轉(zhuǎn)移[8，24]；而蘋果酸可能與Cd發(fā)生螯合作用，使其轉(zhuǎn)變成低毒或無毒的螯合態(tài)存貯在營養(yǎng)體中[25]。由于節(jié)、老葉和基部莖稈中的Cd含量顯著高于旗葉[22-23]，噴施蘋果酸可能促進(jìn)了基部營養(yǎng)體對Cd的固定，抑制了Cd從基部營養(yǎng)體向穗頸和穗軸的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而抑制了Cd向稻米的轉(zhuǎn)運(yùn)。

蘋果酸是植物葉片和根系中最豐富的小分子酸，能通過呼吸作用對許多代謝過程產(chǎn)生調(diào)控作用[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施蘋果酸，不僅對水稻籽粒、穗軸、穗頸和旗葉中的Cd含量產(chǎn)生了顯著抑制作用，而且顯著降低了各器官中的Mn含量（圖2D），但Mg和Fe從旗葉向穗頸的轉(zhuǎn)移以及K、Mn、Zn從穗軸向籽粒的轉(zhuǎn)移效率顯著提高。這可能是因?yàn)樘O果酸通過葉片進(jìn)入植株后，與Cd在細(xì)胞內(nèi)或胞間隙形成的高穩(wěn)定Cd復(fù)合物不易解離，降低了水稻Cd的活度，從而抑制莖葉中的Cd向稻米的轉(zhuǎn)運(yùn)[27]。與此同時(shí)，蘋果酸通過促進(jìn)Mg、K、Fe等必需元素向水稻穗頸的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低了Cd2+和Mn2+與相關(guān)離子通道和載體蛋白結(jié)合的幾率[8，28]，于是顯著降低了稻穗各部位以及稻米中的Cd含量。

表1 蘋果酸、Mn、Zn對水稻Cd和營養(yǎng)元素轉(zhuǎn)移因子的影響Table1 Cd and nutrient elements transfer factors of rice under malic acid，manganese and zinc treatment

水稻開花期葉面噴施ZnCl2，不僅對水稻籽粒、穗軸、穗頸、旗葉中的Cd含量產(chǎn)生了顯著抑制作用，而且籽粒中的Cd含量分配比例從12.55%降至8.66%，提高了各器官中的Zn含量。這可能是因?yàn)镃d與Zn為同族元素，具有相似的化學(xué)性質(zhì)，當(dāng)Cd2+與Zn2+競爭相同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白時(shí)，膜蛋白優(yōu)先結(jié)合水稻生長發(fā)育必需的Zn2+，從而抑制了Cd2+從旗葉向籽粒的轉(zhuǎn)運(yùn)。Cd從穗頸向穗軸轉(zhuǎn)移的過程中，大部分的Cd被攔截在穗頸中，導(dǎo)致Cd的TF穗軸/穗頸顯著下降。噴施ZnCl2促進(jìn)了Mg、K、Mn從旗葉向穗頸的轉(zhuǎn)移，必需營養(yǎng)元素中的陽離子與Cd2+爭奪離子通道，從而降低了Cd在水稻中的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低了籽粒的Cd含量。葉面噴施ZnCl2后，籽粒、穗軸、穗頸中Fe含量均有所增加，與索炎炎等[29]的研究相似。植物從土壤中主要吸收氧化態(tài)的鐵，通常為Fe3+，經(jīng)NAD（P）H還原后轉(zhuǎn)變?yōu)镕e2+再進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Cd2+能和Fe2+競爭相同的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此噴施ZnCl2來提高植株中Fe2+，間接減少了Cd在水稻中的轉(zhuǎn)運(yùn)[30]。因此，葉面噴施ZnCl2，可以通過增加Zn2+濃度，與Cd2+競爭通道，直接影響Cd的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，也可以通過影響其他必需元素的含量，間接抑制Cd的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

大量的研究表明，Mn2+與Cd2+對相關(guān)離子通道和載體蛋白的結(jié)合存在競爭關(guān)系，Mn2+能優(yōu)先結(jié)合細(xì)胞膜上的載體蛋白和通道蛋白，與Cd2+產(chǎn)生拮抗作用[8，28，31]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施 MnCl2，不僅對水稻籽粒、穗軸、穗頸、旗葉中的Cd含量產(chǎn)生了顯著抑制作用，而且對K在相鄰器官間的轉(zhuǎn)移有很大影響。MnCl2顯著促進(jìn)K從穗軸向籽粒中的轉(zhuǎn)移，同時(shí)還促進(jìn)了Mg、K、Mn、Fe、Zn從旗葉向穗頸、Ca從穗頸向穗軸的轉(zhuǎn)移。這些必需元素在穗頸和穗軸中的富集，大幅度降低了Cd與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合的機(jī)會，通過拮抗作用有效抑制了Cd進(jìn)入水稻籽粒的過程。

4 結(jié)論

（1）水稻開花期噴施蘋果酸、MnCl2和ZnCl2能顯著降低成熟期籽粒、穗軸、穗頸和旗葉中的Cd含量，噴施蘋果酸的降Cd效果高達(dá)58.86%，其次是ZnCl2，噴施MnCl2僅使稻米中的Cd含量下降了23.84%。

（2）葉面噴施蘋果酸、MnCl2和ZnCl2對水稻籽粒、穗軸、穗頸、旗葉中礦質(zhì)元素的含量均有不同程度的影響。蘋果酸能顯著降低各器官中的Mn含量；蘋果酸、MnCl2和ZnCl2都能促進(jìn)Mg、K、Mn、Fe從旗葉向穗頸中的轉(zhuǎn)移。

（3）與 10 mmol·L-1MnCl2、10 mmol·L-1ZnCl2相比，噴施5 mmol·L-1蘋果酸能顯著抑制Cd從旗葉向穗頸的轉(zhuǎn)移，使穗頸和穗軸中的Cd濃度大幅度下降。