賈 瑋，張焱茜，鄒 力，樊 成，陳雪峰，儲(chǔ)曉剛, 3

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021; 2.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710048; 3.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

0 引言

抗生素是世界上用量最大、使用范圍最廣的藥物之一，在畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛，全球抗生素的年均使用總量約為200 000噸[1-3].在漁業(yè)養(yǎng)殖中，抗生素主要用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、疾病的預(yù)防和治療.若使用不規(guī)范，會(huì)在動(dòng)物源性食品中產(chǎn)生藥物殘留[4-7].抗生素按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、磺胺類(lèi)等[8].而國(guó)內(nèi)目前關(guān)于抗生素類(lèi)藥物殘留的研究多限于同類(lèi)藥物的測(cè)定[9-12].

羅非魚(yú)為主要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，含有多種不飽和脂肪酸和豐富的蛋白質(zhì)，被譽(yù)為“不需要蛋白質(zhì)的蛋白源”[13,14].基于此，本課題以羅非魚(yú)為研究對(duì)象，預(yù)建立同時(shí)測(cè)定羅非魚(yú)中4類(lèi)9種抗生素藥物殘留的篩查方法，旨在為監(jiān)控漁業(yè)養(yǎng)殖中抗生素多殘留提供技術(shù)支持，為食品安全監(jiān)管提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、甲酸(色譜純),德國(guó)Merck公司；恩諾沙星、達(dá)氟沙星、四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、氯霉素、氟苯尼考及甲砜霉素(純度均大于95%),德國(guó)Dr.Erenstofer公司；無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水乙酸鈉、氯化鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉,德國(guó)Sigma公司；C18、PSA,美國(guó)Welch公司.

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫6550 iFunnel Q-TOF四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有安捷倫1260型高效液相色譜儀及電噴霧離子源,美國(guó)Agilent Technologies公司；Milli Q 超純水系統(tǒng),美國(guó)Millipore公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī),湘儀離心機(jī)儀器有限公司；數(shù)顯渦旋混合器,美國(guó)Fisher Scientific公司.

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃待用.實(shí)驗(yàn)中根據(jù)需要配制不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配.

1.3.2 樣品前處理

稱取1.0 g經(jīng)均質(zhì)的樣品(精確至0.01 g)于聚四氟乙烯離心管中，加入2.5 mL甲醇，采用酸化乙腈溶液(乙腈∶水∶乙酸=84∶15∶1,v/v)定容至12.5 mL，再加入2.5 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine(pH=4.0)，震蕩渦旋；加入無(wú)水硫酸鎂1.0 g、乙酸鈉1.5 g及氯化鈉1.9 g，震蕩渦旋，于8 000 r/min離心10 min；取上清液至試管中，加入C18 0.4 g、PSA 0.4 g及0.1 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋震蕩，離心，分別取上清液及下清液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，上機(jī)測(cè)定.

1.3.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD AQ 柱(100 mm×4.6 mm，5 mm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相A為水+0.20 %甲酸+4.00 mmol/L甲酸銨，B為甲醇+0.20%甲酸+4.00 mmol/L甲酸銨；梯度洗脫程序：0.00～1.00 min，100% A，1.00～7.00 min，100%～0% A，7.00～9.00 min，0% A，9.00～11.00 min，0%～100% A，11.00～15.00 min，100% A；流速：0.30 mL/min；進(jìn)樣量：10.00μL.

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI+及ESI-)；毛細(xì)管電壓4.00 kV(ESI-為3.50 kV)，噴嘴電壓1.00 kV；干燥氣溫度280.00 ℃；干燥氣流量13.00 L/min；霧化氣壓力20.00 psig；鞘氣溫度350.00 ℃；鞘氣流量12.00 L/min.

2 結(jié)果與討論

2.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件的選擇

本研究考察正、負(fù)兩種離子模式測(cè)定9種目標(biāo)化合物的響應(yīng)特點(diǎn).沙星類(lèi)及四環(huán)素類(lèi)6種化合物在正模式下具有較強(qiáng)的響應(yīng)；氯霉素類(lèi)3種化合物在負(fù)模式下具有較強(qiáng)的響應(yīng).通過(guò)優(yōu)化離子源參數(shù)，確認(rèn)分子離子峰，并進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到分子離子、碎裂離子及最佳碰撞能量等信息，如表1所示.

考察了甲醇-水和酸化甲醇-水(0.2%甲酸+4 mmol/L甲酸銨)兩種流動(dòng)相體系對(duì)分離效果的影響.結(jié)果表明，酸化甲醇-水溶液作為流動(dòng)相可有效分離9種目標(biāo)化合物，且峰形良好.其中，四環(huán)素及強(qiáng)力霉素作為同分異構(gòu)體也能達(dá)到良好的分離，如圖1及圖2所示；采用甲醇-水流動(dòng)相體系時(shí)，四環(huán)素、土霉素、金霉素及強(qiáng)力霉素不能有效成峰，如圖3所示.酸性緩沖液作為流動(dòng)相能增強(qiáng)靈敏度、提高目標(biāo)化合物的離子化效率、增強(qiáng)響應(yīng)強(qiáng)度，這主要是由于酸提供了更佳的質(zhì)子化環(huán)境[15].但酸性過(guò)強(qiáng)易縮短色譜柱壽命，故本研究選擇0.2%甲酸+4 mmol/L甲酸銨來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH.

圖1 ESI+條件下6種抗生素的離子流圖

表1 9種抗生素的質(zhì)譜采集參數(shù)

圖2 ESI-條件下3種抗生素的離子流圖

圖3 以甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)四環(huán)素類(lèi)物質(zhì)的離子流圖

2.2 提取溶劑的選擇

9種抗生素均含有極性基團(tuán)，根據(jù)相似相溶原理，更易溶解于極性有機(jī)溶劑中.乙腈為抗生素多殘留檢測(cè)最常用的提取溶劑，然而采用純乙腈提取無(wú)法兼顧極性大的抗生素，通過(guò)加入水相調(diào)整提取液極性可提取到不同極性的目標(biāo)物質(zhì)；此外，四環(huán)素類(lèi)化合物中所含的氨基基團(tuán)在酸性條件下帶正電荷且易溶于水，故初步選擇酸化乙腈溶液(乙腈∶水∶乙酸=84∶15∶1,v/v)作為提取劑.結(jié)果顯示，喹諾酮類(lèi)及氯霉素類(lèi)抗生素能得到有效提取，而四環(huán)素類(lèi)化合物在該溶劑的作用下大量損失.考慮到四環(huán)素類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)屬于氫化并四苯環(huán)衍生物，其C10酚羥基和C12烯醇基能與金屬離子如Ca2+、Mg2+形成絡(luò)合物沉淀[16].羅非魚(yú)基質(zhì)含有一定量的Ca2+及Mg2+，同時(shí)因無(wú)水硫酸鎂作為鹽析劑引入了大量Mg2+，導(dǎo)致四環(huán)素類(lèi)化合物與Ca2+、Mg2+絡(luò)合沉淀，無(wú)法萃取至乙腈層中，故在提取過(guò)程中引入0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine溶液，采用EDTA螯合溶液中的Ca2+和Mg2+，釋放四環(huán)素類(lèi)化合物進(jìn)入溶液參與萃取過(guò)程.

當(dāng)引入Na2EDTA-Mcllvaine溶液后樣液出現(xiàn)分層現(xiàn)象.過(guò)程中觀察到下層液體相比于上層液體，溶液混濁且體積較小，因此，本研究于前處理初期，在樣品中引入2.5 mL甲醇.結(jié)果顯示經(jīng)甲醇、酸化乙腈及Na2EDTA-Mcllvaine三種溶劑綜合提取后，再配合無(wú)水硫酸鎂、C18、PSA等凈化劑的作用，有效沉淀了樣品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)、脂肪、色素等物質(zhì)，增強(qiáng)了凈化效果.取上下清液分別上機(jī)檢測(cè)，氯霉素類(lèi)3種物質(zhì)在上清液中回收率良好，喹諾酮類(lèi)及四環(huán)素類(lèi)6種物質(zhì)在下清液中回收率相對(duì)較高(<80 %)，四環(huán)素類(lèi)4種物質(zhì)的回收率得到明顯改善,如圖4所示.

圖4 4種四環(huán)素類(lèi)物質(zhì)在不同成分提取劑下的回收率(n=6)

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

本研究選取羅非魚(yú)樣品考察基質(zhì)效應(yīng).通過(guò)計(jì)算溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線及基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的比值進(jìn)行評(píng)價(jià).采用空白基質(zhì)樣液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至0.75 mg/kg、1.50 mg/kg、2.25 mg/kg、3.00 mg/kg、3.75 mg/kg，與同濃度純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液一同上機(jī)測(cè)定.由于分散固相萃取法可分析的抗生素范圍廣、凈化效果好，為目前抗生素類(lèi)藥物殘留分析中最為有效的凈化方法，適合多種類(lèi)藥物的同時(shí)分析[17].故在前處理中，采用分散固相萃取法凈化基質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)，并結(jié)合基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正法，最大限度消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)準(zhǔn)確性的影響.從表2可知，空白羅非魚(yú)基質(zhì)的9種抗生素藥物的基質(zhì)效應(yīng)值在0.84～1.17范圍內(nèi)，基質(zhì)效應(yīng)較弱，以恩諾沙星為例，如圖5所示.

圖5 以溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線及基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的比值考察恩諾沙星基質(zhì)效應(yīng)

2.3.2 線性范圍與檢出限

在空白樣品中添加0.75 mg/kg、1.50 mg/kg、2.25 mg/kg、3.00 mg/kg、3.75 mg/kg系列水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按前處理方法處理后上機(jī)測(cè)定.以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)加標(biāo)工作曲線，得到本方法的線性范圍、回歸曲線方程及相關(guān)系數(shù)，如表2所示.結(jié)果表明，9種化合物在該范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.90.分別以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算羅非魚(yú)中9種抗生素的檢出限及定量限，沙星類(lèi)化合物的檢出限和定量限分別為0.31～0.36μg/kg及1.04～1.20μg/kg，四環(huán)素類(lèi)化合物的檢出限和定量限分別為10.81～16.37μg/kg及36.04～54.56μg/kg，氯霉素類(lèi)化合物的檢出限和定量限分別為0.55～1.20μg/kg及1.84～4.00μg/kg.

2.3.3 回收率和精密度

取羅非魚(yú)基質(zhì)空白樣品，添加一定量的9種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2節(jié)所述步驟進(jìn)行前處理，考察日內(nèi)、日間精密度.于同一天不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定3次，每次進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測(cè)定3天，結(jié)果見(jiàn)表3所示.由表3可知，9種抗生素的平均回收率為78.04%～103.08%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.37%～9.92%，日內(nèi)和日間RSD范圍分別為1.37%～9.86%和3.86%～9.92%，表明所建方法具有良好的精密度.

表2 羅非魚(yú)中9種抗生素的相關(guān)技術(shù)指標(biāo)

表3 9種抗生素的日內(nèi)和日間精密度(n=9)

3 結(jié)論

本研究將分散固相萃取法與超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法聯(lián)用，建立了準(zhǔn)確測(cè)定羅非魚(yú)中9種抗生素殘留的方法，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正法定量.所建立的方法操作簡(jiǎn)單、基質(zhì)干擾少、回收率高、重復(fù)性好，可用于羅非魚(yú)中9種抗生素的測(cè)定，適合大批量樣品的監(jiān)測(cè)分析，從而為食品安全監(jiān)管提供一定的技術(shù)支持.