,,,,,,*

(1.暨南大學食品科學與工程系,廣東廣州510632; 2.廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所,廣西崇左532415)

澳洲堅果(MacadamiaternifoliaF. Muell.)是山龍眼科、澳洲堅果屬植物,營養(yǎng)價值和保健價值高,原產(chǎn)于澳大利亞[1],世界熱帶地區(qū)均已有栽培,我國云南、廣東、廣西等省已大量栽培。澳洲堅果果實由外殼(青皮)、殼(木質(zhì)硬殼)和果仁組成[2]。其中,圓形、奶香味的果仁是其唯一的可食用部分,營養(yǎng)豐富,除高含量的脂質(zhì)(60%以上)外,還含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、多種重要微量元素和其他生物活性物質(zhì),屬高檔干果,有“干果之王”之稱。

澳洲堅果品種甚多,但僅光殼型澳洲堅果(M.Integrifolia)和粗殼澳洲堅果(M.Tetraphylla)及其雜交種有商業(yè)價值,其他品種均因其果仁中的蜀黍苷(圖1,I,一種生氰糖苷)含量較高而不宜食用，或脫氰后才可以食用[3]。Miller等[4]對澳洲堅果幼苗中的生氰糖苷進行測定,稱多數(shù)澳洲堅果品種含有蜀黍苷與proteacin兩種生氰糖苷,但成熟澳洲堅果各部位蜀黍苷的含量目前仍未見有報道。而我國廣西、云南等地現(xiàn)有用澳洲堅果花、葉泡茶[5],其青皮用作飼料或生產(chǎn)抗氧化劑[6]和化妝水[7],其殼用于生產(chǎn)吸附劑[8]等方面的報道,故有必要對澳洲堅果各部位的糖苷毒性進行評估,以保證其用于食品、化妝品和其他領域產(chǎn)品開發(fā)利用的安全性。

圖1 蜀黍苷酶解途徑和苦杏仁苷分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Enzymatic hydrolysis pathway of dhurrin and the molecular structure of amygdalin

由蜀黍苷生成氫氰酸(HCN)分為兩步。其先被內(nèi)源性蜀黍苷酶(dhurrinase,EC 3.2.1.21,屬于β-D-葡萄糖苷酶)水解,生成葡萄糖和不穩(wěn)定的對羥基-(S)-扁桃腈(圖1,II);此中間產(chǎn)物再在內(nèi)源性R-羥基腈裂解酶的作用下或堿性條件下,快速轉(zhuǎn)化為游離HCN和對羥基苯甲醛(見圖1)。

生氰糖苷含量的測定方法包括間接法和直接法。間接法主要通過檢測糖苷水解所釋放的HCN以定量生氰糖苷,常用的有巴比妥酸法[9]、堿性苦味酸鹽法[10]、硝酸銀滴定法、分光光度法[11]、氰化物電極測定法[12]等。這些方法所用儀器簡單,但精密度、準確度均較低。為準確、快速、簡便地檢測澳洲堅果中的生氰糖苷,本實驗擬選用價廉易得的苦杏仁苷(圖1,IV)作為內(nèi)標物質(zhì),用高壓液相色譜法(HPLC)直接定量樣品中的蜀黍苷,為成熟澳洲堅果各部位的毒性評估和開發(fā)應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

澳洲堅果仁及其油粕、花、葉、青皮、殼 均由廣西省壽香鄉(xiāng)有機農(nóng)業(yè)產(chǎn)品開發(fā)有限公司惠贈(品種包括HAES900、桂熱、Own Choice、A16、Pahala、Beaumont,其中所用果仁、青皮和殼取自成熟果實,葉子為幼葉);水：怡寶純凈水 華潤怡寶食品飲料(深圳)有限公司;0.45 μm微孔濾膜 天津津騰試驗設備有限公司;蜀黍苷標準品 純度≥90%,經(jīng)歸一化法測定后,按90%計算 法國Extrasynthése公司;苦杏仁苷標準品 純度≥98%，成都德斯特生物技術(shù)有限公司;乙腈 HPLC級，歐普森試劑有限公司;無水乙醇 HPLC級，天津市科密歐化學試劑有限公司;甲酸 分析純，天津化學試劑一廠。

Shimadzu LC-20AT 高效液相色譜儀 日本島津公司;Alltech ELSD 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器 美國Alltech公司;FA1104N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司;SB-5200DTS超聲波清洗機 寧波新藝超聲設備有限公司;KDC-1044離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;111型高速中藥粉碎機 瑞安市永歷制藥機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品提取與制備

1.2.1.1 澳洲堅果花與葉待測樣品的制備 參考Kobaisy等[13]所述方法進行澳洲堅果中蜀黍苷的提取,將澳洲堅果花、葉凍干粉碎后,精密稱取0.33 g于50 mL容量瓶中,70%乙醇定容后室溫下超聲30 min。取出,放置過夜。第二天定容后取適量提取液3500 r/min離心30 min。取一定量該上清液,加入已知濃度的苦杏仁苷標準品溶液,0.45 μm微孔濾膜過濾后置于1.5 mL自動進樣瓶,HPLC檢測。

1.2.1.2 澳洲堅果仁和青皮、果殼樣品的制備 澳洲堅果仁稱重,粉碎后用正己烷脫脂,干燥至恒重,記錄重量。澳洲堅果冷榨油粕亦用正己烷脫脂后干燥至恒重。稱取1.36 g脫脂油粕粉置于50 mL 容量瓶中;將澳洲堅果青皮、殼樣品進行干燥,粉碎,精密稱取2 g于100 mL容量瓶中,70%乙醇定容,其余步驟同澳洲堅果花和葉的處理過程。

1.2.2 HPLC和HPLC-MS分析條件 使用Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)柱溫35 ℃;流動相為乙腈(A)和0.1%甲酸溶液(B)進行梯度洗脫[14],優(yōu)化洗脫梯度如表1所示,進樣量5 μL,流速:1.0 mL/min;ELSD以干燥潔凈的壓縮空氣為霧化氣體,壓力0.5 MPa,氣體流速3.0 L/min,漂移管溫度100 ℃,增益值1。通過預實驗證實,該條件下,方法噪音信號較小,基線平穩(wěn)。通過比較樣品與標準品的保留時間和峰面積可對樣品中的蜀黍苷進行定性定量分析。

表1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution of HPLC analysis

質(zhì)譜條件為:ESI為離子源,同時進行正、負離子模式掃描,離子源溫度350 ℃,霧化壓力25 psi,干燥氣體為N2，流速10 L/min,CID氣流230 kPa,DL溫度250 ℃,加熱塊溫度400 ℃,接口溫度300 ℃,質(zhì)量掃描范圍m/z為300～550。

1.2.3 標準曲線的測定 精密稱取5.2 mg蜀黍苷標準品,甲醇溶解定容并進行稀釋,得濃度分別為0.52、0.38、0.26、0.13、0.065、0.0325 mg/mL的系列蜀黍苷標準品溶液(-20 ℃保存,1個月內(nèi)用完[15])。另精密稱取8.3 mg內(nèi)標物苦杏仁苷,用甲醇溶解并定容至25 mL,得濃度0.332 mg/mL的苦杏仁苷標準溶液。分別取上述不同梯度蜀黍苷標準溶液各2 mL于5 mL容量瓶中,各加2 mL苦杏仁苷標準品溶液,甲醇定容至刻度,搖勻,即得含內(nèi)標物質(zhì)的系列梯度標準品溶液。0.45 μm微孔濾膜過濾后置于1.5 mL進樣瓶中,HPLC分析,分別記錄蜀黍苷與苦杏仁苷的峰面積。

式(1)

式中,ωD為樣品中蜀黍苷的含量(mg/g),ci(mg/mL)為使用標準工作曲線所得樣品提取液中蜀黍苷的濃度(mg/mL),Vextr為提取液總體積(mL),m為樣品重量(g)。

1.2.5 方法學試驗

1.2.5.1 精密度試驗 按照1.2.3中的方法精確配制濃度分別為0.21、0.27 mg/mL的蜀黍苷-苦杏仁苷甲醇標準品溶液,連續(xù)進樣5次,進樣體積為5 μL,對試驗結(jié)果的精密度進行分析。

1.2.5.2 重復性試驗 平行提取澳洲堅果花樣品5份,每個樣品重復進樣5次以考察HPLC分析的重復性。

1.2.5.3 回收率試驗 以澳洲堅果花為分析對象,5個平行樣品分別加入一定量不同濃度的蜀黍苷-苦杏仁苷混合標準品溶液(其中蜀黍苷濃度分別為0.013、0.0104、0.0078、0.0052和0.0026 mg/mL,苦杏仁苷濃度分別為0.107、0.0785、0.0615、0.0415、0.027 mg/mL)進行提取。每個樣品重復進樣兩次,取其平均值后,按照1.2.2所述標準曲線定量提取液中的蜀黍苷,并與添加量進行比較以計算回收率。

1.2.5.4 穩(wěn)定性試驗 制備澳洲堅果花提取液,分別于0、2、4、8、24 h測定蜀黍苷含量,計算相對標準偏差RSD。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果用Microsoft Excel和SPSS進行分析,取3次或5次平行實驗結(jié)果的平均值。結(jié)果均表示為平均值±標準差,并對幾次平行結(jié)果的相對標準偏差(RSD)進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦杏仁苷符合測定蜀黍苷內(nèi)標物的標準

對比蜀黍苷(圖1,I)與苦杏仁苷(圖1,IV)的分子式可以看出:兩者結(jié)構(gòu)相近,應當具有類似的色譜行為。由圖2可以看出:蜀黍苷(圖2A峰)保留時間6.960 min,峰型對稱,分離效果良好;苦杏仁苷(圖2B峰)保留時間為7.351 min,與蜀黍苷峰相近且完全分離,無干擾,即苦杏仁苷與蜀黍苷保留時間較為接近,可以作為澳洲堅果中蜀黍苷測定的內(nèi)標物質(zhì)。此外,在相同實驗條件下,蜀黍苷與苦杏仁苷的相對保留時間(蜀黍苷保留時間/苦杏仁苷保留時間)約為0.95∶1,可在本洗脫、測定條件下,作為蜀黍苷的定性分析作參考指標。

圖2 澳洲堅果花提取樣品的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of macadamia flower extraction注:3為蜀黍苷與苦杏仁苷混合標準品,2為加入苦杏仁苷的澳洲堅果花提取液,1為未加苦杏仁苷的澳洲堅果花提取液。

采用液質(zhì)聯(lián)用法對圖2A峰進行測定,在ESI正離子模式下,該峰的一級質(zhì)譜離子峰為:[M+NH4]+329,[M+Na]+334,[M+K]+350;負離子模式下,離子峰為:[M-H]-310,[M+Cl]-346,[M+HCOO]-356。據(jù)這些相關峰,可以計算出準分子離子峰的分子量M為311,而蜀黍苷分子式C14H17NO7,其分子量也是311。從上述HPLC保留時間與HPLC/MS兩方面的證據(jù),均證實圖2A峰為蜀黍苷。由此可見,澳洲堅果樣品中不含苦杏仁苷(圖2B)、而兩種生氰糖苷色譜行為相同,即杏仁苷可以作為內(nèi)標測定澳洲堅果中的蜀黍苷。

2.2 蜀黍苷的標準工作曲線

將一定濃度的蜀黍苷標準品甲醇溶液進行逐級稀釋,并用HPLC定量檢測,信噪比為3時所對應的蜀黍苷溶液濃度即為本方法的檢出限。結(jié)果顯示,檢出限為3.0×10-3mg/mL,檢測范圍為0.0330～0.4554 mg/mL。

2.3 方法學試驗

按1.2.5所述進行方法學試驗,所獲結(jié)果見表2。精密度試驗結(jié)果RSD為2.60%,儀器精密度良好。重復性試驗結(jié)果的RSD為1.50%,表明方法重復性良好。24 h內(nèi),樣品中蜀黍苷定量結(jié)果的RSD為0.82%,平均回收率為97.93%±2.35%,RSD為2.39%,檢測結(jié)果可靠。因此,從穩(wěn)定性、回收率、準確度等方面考慮,該法是測定澳洲堅果中的蜀黍苷含量的適宜方法。

表2 方法學試驗結(jié)果Table 2 Results of methodology test

2.4 澳洲堅果各部位蜀黍苷的含量和毒性評估

2.4.1 澳洲堅果各部位蜀黍苷的含量 HPLC-ELSD內(nèi)標法測定澳洲堅果各部位蜀黍苷含量的結(jié)果見表3,其中澳洲堅果花中蜀黍苷的含量最高(49.92±0.96) mg/g,其后依次為葉>青皮>殼>油粕>果仁,這與Dahler等[17]所述生氰糖苷主要存在于生長代謝旺盛組織的報道一致。由表4可知,不同品種澳洲堅果青皮中蜀黍苷含量存在較大差異,其中含量最少的為Pahala,測定結(jié)果為(0.51±0.03) mg/g;含量最高的為Beaumont,測定結(jié)果為(5.74±0.08) mg/g,相差2～15倍。因此,在選育澳洲堅果品種、考慮利用澳洲堅果青皮資源時,應當以蜀黍苷含量作為重要品質(zhì)指標之一。

表3 澳洲堅果不同部位蜀黍苷的含量(不同品種的平均值)Table 3 Dhurrin content in different part of macadamia(Average value of different cultivars)

表4 不同品種澳洲堅果青皮中蜀黍苷的含量Table 4 Dhurrin content in different macadamia husks

2.4.2 澳洲堅果各部位用作食品原料的安全性分析 生氰糖苷的毒性是由其水解所得氰氫酸和醛類化合物產(chǎn)生的,氰氫酸最小致死口服劑量為0.5～3.5 mg/kg體重[18]。而對于人體,若體重按50 kg算,口服約25 mg HCN致死;換算成對應蜀黍苷含量(假設完全水解成產(chǎn)物),該劑量相當于澳洲堅果花、葉、果仁、油粕、殼、青皮(干重計)分別為19.58、36.04、1078、308.27、709.38、269.56 g。可以看出:澳洲堅果仁蜀黍苷含量最低,而且每日攝入量一般小于100 g,因此,食用澳洲堅果仁不會導致氫氰酸中毒,即食用澳洲堅果仁是安全的。但澳洲堅果花、葉、油粕、殼、青皮中蜀黍苷含量則相對較高,尤其是花的含量最高;若將花、葉等部位用于生產(chǎn)茶類(每天攝入量小于2～4 g)時,亦應當是安全的;但若將其用作飼料,由于牲畜日攝入量比較大,則應考慮脫除蜀黍苷以保證牲畜安全。實際上,蜀黍苷酶解不可能完全產(chǎn)生游離HCN,其具體的轉(zhuǎn)化率則視植物組織受損情況、環(huán)境溫度、pH等諸多因素影響,故具體的轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)還有待后續(xù)實驗研究。因此,如果擬利用澳洲堅果花、幼葉加工花茶、浸泡酒等食品時,應當考慮脫除其所含的蜀黍苷;而澳洲堅果的青皮、殼、油粕、果仁中蜀黍苷含量一般低于5 mg/g,可以不采用脫除蜀黍苷的工藝處理措施。

3 結(jié)論

選用苦杏仁苷作為內(nèi)標物質(zhì),使用HPLC-ELSD內(nèi)標法對澳洲堅果花、葉、果仁、青皮和殼中的蜀黍苷進行定量檢測,試驗結(jié)果表明該方法準確度、穩(wěn)定性和重復性均較好,可作為澳洲堅果中蜀黍苷的一種快速簡便的檢測方法。通過對澳洲堅果不同部位蜀黍苷含量進行定量分析,其中花中蜀黍苷含量最高,葉次之,而果仁中僅含微量的蜀黍苷,在安全食用范圍之內(nèi)?？嘈尤省y杏等中草藥中所含的生氰糖苷,常常是其重要的活性成分;而對于單蜀黍苷的生物活性則有待進一步研究。