江華明，劉松青，李仁全，彭萬(wàn)仁，張小平

(1.四川職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 遂寧 629000;2.成都師范學(xué)院，四川成都 611730;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，四川 成都 611130)

【研究意義】川西高寒山區(qū)是指四川阿壩州、甘孜州區(qū)域內(nèi)海拔1500 m以上的橫斷山區(qū)，位于青藏高原東部。該區(qū)域氣候冷涼、降雨較少，晝夜溫差大。其中，甘孜州屬青藏高原氣候，年均氣溫在5～10℃之間，年降水量在400～1000 mm之間，具有氣溫低、冬季長(zhǎng)、日照足的特點(diǎn)。阿壩州山原地帶為溫涼半濕潤(rùn)氣候，夏季溫涼，冬春寒冷，干濕季明顯;年平均氣溫5.6～8.9℃，且隨著海拔高度的變化，氣候從亞熱帶到溫帶、寒溫帶、寒帶，呈明顯的垂直性差異。川西高寒山區(qū)是青藏高原藥用植物資源的重要分布區(qū)。黃芪屬植物約2000多種，廣泛分布于歐洲、亞洲、南美洲及非洲。我國(guó)278種，2亞種、35變種、2變型，本屬植物主要用于牲畜飼料、藥用和綠肥［1］。四川約有67種12變種1變型。甘孜州有47種9變種［2］。【前人研究進(jìn)展】目前對(duì)川西高寒山區(qū)黃芪根瘤菌資源研究的不多。李瓊芳［3］從四川省甘孜州海拔3650 m的瓦澤鄉(xiāng)和海拔4250 m的折多山的黃花黃芪(Astragalus gilviflorus)和梭果黃芪(Astragalus stii)分離得到33株根瘤菌。采用數(shù)值分類(lèi)和不同的分子生物學(xué)方法進(jìn)行分析結(jié)果顯示，33個(gè)菌株均屬于 Mesorhizobium。周蜃等［4］對(duì)其中一個(gè)分支中包含SCAU7，SCAU11，SCAU27的菌株進(jìn)一步進(jìn)行共生基因(nodC、nifH)序列分析、DNA同源性分析、細(xì)胞脂肪酸組成成分分析，最終確定SCAU7T和SCAU27為新種群，命名為Mesorhizobium sangaii，菌株SCAU7T作為該新種的模式菌株?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究從采集自四川甘孜藏族自治州和阿壩藏族羌族自治州的10種具有一定藥用價(jià)值的黃芪植物［1］(膜莢黃芪 Astragalus membranaceus，云南黃芪 A.yunnanensis，長(zhǎng)小苞黃芪 A.balfourianus，單蕊黃芪 A.monadelphus，窄翼黃芪 A.degensis，腎行子黃芪 A.skythropos，康定黃芪 A.tatsienensis，厚葉黃芪 A.crassifolius，梭果黃芪 A.ernestil，彎齒黃芪A.camptodontus)的根瘤中分離根瘤菌，測(cè)定分離株的耐鹽性、初始pH生長(zhǎng)范圍及生長(zhǎng)溫度范圍等生理指標(biāo)，并采用BOXAIR-PCR、16S rDNA PCR-RFLP及16S rDNA序列分析等方法。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】揭示該區(qū)域野生藥用黃芪根瘤菌的遺傳多樣性，為優(yōu)良菌株的選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 根瘤樣本的采集 從四川甘孜州康定、道孚、爐霍、甘孜、稻城、雅江等6個(gè)縣10個(gè)采樣點(diǎn)及四川阿壩州黃龍寺采集到藥用黃芪植物根瘤及土壤樣品，并記錄根瘤的形狀及結(jié)瘤部位。

表1 藥用黃芪根瘤菌供試菌株及參比菌株Table 1 Strains isolated from medicinal plants of Astragalus spp.and reference strains

注:R:Rhizobium，M:Mesorhizobium，Ag:Agrobacterium。

1.1.2 藥用黃芪植物根瘤菌的分離和純化 藥用黃芪植物根瘤菌的分離和純化參照Vincent的方法［5］。用無(wú)菌水浸泡清洗根瘤，再用75%酒精和0.1%HgCl2分別對(duì)根瘤表面消毒5和3 min，用無(wú)菌水沖洗3次。在無(wú)菌培養(yǎng)皿中磨碎根瘤，取根瘤懸液在YMA平板上劃線(xiàn)，置28℃恒溫箱中培養(yǎng)7～10 d，挑取表面濕潤(rùn)、光滑、突起、有莢膜多糖產(chǎn)生的單菌落，采用劃線(xiàn)法反復(fù)純化，革蘭氏染色鏡檢。陰性純菌株接種于YMA斜面，28℃培養(yǎng)3d，4℃短期保藏，30%甘油管中－80℃長(zhǎng)期保藏［6］。分離的供試菌株和參比菌株列表1。

1.2 BOXAIR-PCR 指紋分析

總DNA的提取參照 Little［7］的方法。提取的DNA保存于－20℃?zhèn)溆?。BOXAIR-PCR指紋分析中，引物為 BOXAIR:5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’。反應(yīng)體系(25 μl)為:2 × PCR Mix 12.5 μl;BOXAIR 引物(10 μM)0.5 μl;模板 DNA(50 ng/mL)1.0 μl;雙蒸水11 μl;擴(kuò)增程序:95 ℃變性4 min;95℃變性1 min，54℃復(fù)性1 min，65℃延伸8 min，循環(huán)35次;65℃最終延伸11 min。4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳(80 V，2 h)檢測(cè)，凝膠UV成像系統(tǒng)成像，以JPG形式保存［6］。

1.3 16S rDNA PCR-RFLP指紋圖譜分析

以總DNA為模板，選用來(lái)源于大腸桿菌16S rDNA基因序列保守區(qū)域的兩段引物P1和P6來(lái)擴(kuò)增16SrDNA。正向引物P1:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’。其序列對(duì)應(yīng)于 E.coli第8-37堿基位置;反向引物P6:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’。其序列對(duì)應(yīng)于E.coli第1479～1506堿基位置。擴(kuò)增16SrDNA和酶切反應(yīng)體系反應(yīng)體系請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn)［6］。

1.4 供試菌株16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

擴(kuò)增全部35株供試菌株的16S rDNA片段(反應(yīng)體系和程序同1.3)，擴(kuò)增產(chǎn)物(1500 bp)經(jīng)檢測(cè)后送北京華大基因有限公司測(cè)定序列。

1.5 菌株生理特性分析

對(duì)35株根瘤菌分別進(jìn)行耐鹽性、初始pH生長(zhǎng)范圍及生長(zhǎng)溫度范圍的測(cè)定［6］。

1.6 數(shù)據(jù)分析和處理

采用Nei等［8］的方法計(jì)算材料間遺傳相似系數(shù)(GS)，GS=2Nij/(Ni+Nj)，其中，Ni代表第 i個(gè)品種的擴(kuò)增帶紋數(shù)目，Nj代表第j個(gè)品種的擴(kuò)增帶紋數(shù)目，Nij代表第i、j個(gè)品種間共有的帶紋數(shù)目。通過(guò)NTSYS2.10e軟件中的基于非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析，并轉(zhuǎn)化為樹(shù)狀圖譜;利用NTSYS-pc(Version 2.10e)軟件進(jìn)行GS相似性系數(shù)分析，并通過(guò)EIGEN程序進(jìn)行主成分分析;將所測(cè)供試菌株16S rDNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取序列號(hào)(表1)。采用 Blast search在線(xiàn)分析及DNAMAN6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，找出各序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中最近緣種的模式菌株序列，再用MEGA 5.0中的Clustal X程序進(jìn)行多序列比對(duì)，用Neighbor-Joining方法選擇Bootstrap為1000個(gè)重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育學(xué)進(jìn)化樹(shù)［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥用黃芪根瘤菌分離及BOXAIR-PCR指紋分析

從10種藥用黃芪(膜莢黃芪Astragalus membranaceus，云南黃芪 A.yunnanensis，長(zhǎng)小苞黃芪 A.balfourianus，單蕊黃芪 A.monadelphus，窄翼黃芪 A.degensis，腎 行 子 黃 芪 A.skythropos，康 定 黃 芪 A.tatsienensis，厚葉黃芪 A.crassifolius，梭果黃芪 A.ernestil，彎齒黃芪A.camptodontus)的根瘤中分離得了35個(gè)根瘤菌菌株作為供試菌株，另外，選取了屬于 Rhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobium、Agrobacterium的參比菌株14個(gè)(表1)。對(duì)這些菌株開(kāi)展了系列研究。

以各菌株總DNA為模板，BOXAIR為引物，對(duì)35株供試藥用黃芪植物根瘤菌進(jìn)行BOXAIR-PCR，在2%瓊脂糖凝膠電泳板上得到BOXAIR-PCR指紋圖譜(圖1)。

在相似系數(shù)84.6%的水平，35個(gè)藥用黃芪供試菌株和14個(gè)參比菌株中，除6個(gè)供試菌株單獨(dú)分開(kāi)(SCAU 609;SCAU487;SCAU596;SCAU491;SCAU549;SCAU550)外，其余菌株聚成6個(gè)遺傳群(圖2)。

將采用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析的結(jié)果轉(zhuǎn)換為協(xié)表征矩陣，對(duì)協(xié)表征矩陣和相似系數(shù)矩陣的相關(guān)性進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)。結(jié)果表明，2種矩陣顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù) r=0.853，P=0.005，說(shuō)明聚類(lèi)結(jié)果能較準(zhǔn)確地反映菌株之間的遺傳關(guān)系。

圖1 藥用黃芪根瘤菌部分菌株BOXAIR-PCR指紋圖譜Fig.1 BOXAIR-PCR figureprints of the strains isolated from medicinal plants of Astragalus sp.

圖2 藥用黃芪根瘤菌BOXAIR-PCR聚類(lèi)分析圖Fig.2 Dendrogram based on BOXAIR-PCR fingerprints of the strains tested

2.2 16S rDNA PCR-RFLP聚類(lèi)分析和主成分分析(PCA)

2.2.1 PCR-RFLP聚類(lèi)分析 由圖3可知，以P1和P6為引物對(duì)49個(gè)菌株(35個(gè)供試菌株和14個(gè)參比菌株)的16S rDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，分別用Hae III、Msp I、Hinf I和 Taq I對(duì)擴(kuò)增的 1.5 kb 片段進(jìn)行酶切，2%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳形成圖譜。

對(duì)49個(gè)菌株的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切條帶利用UPGMA進(jìn)行聚類(lèi)分析并生成樹(shù)狀圖譜。

在相似系數(shù)83%的水平上，所有供試菌株均與參比菌株完全分開(kāi)。在供試菌株中，SCAU549、SCAU568、SCAU596單獨(dú)分開(kāi)，其余菌株聚成4個(gè)遺傳群。

圖3 藥用黃芪根瘤菌16S rDNA PCR-RFLP聚類(lèi)Fig.3 Dendrogram based on 16S rDNA PCR-RFLP of the tested strains

圖4 藥用黃芪根瘤菌及參比菌株16S rDNA PCR-RFLP主成分分析三維圖Fig.4 3-d PCA for 16S rDNA PCR-RFLP of strains isolated from medicinal plants of Astragalus and reference strains

將采用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析的結(jié)果轉(zhuǎn)換為協(xié)表征矩陣，對(duì)協(xié)表征矩陣和相似系數(shù)矩陣的相關(guān)性進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)。結(jié)果表明，2種矩陣顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù) r=0.835，P=0.005，說(shuō)明聚類(lèi)結(jié)果能較準(zhǔn)確地反映菌株之間的遺傳關(guān)系。

35個(gè)供試菌株4種酶酶切后共形成27種基因型，通過(guò)Simpson指數(shù)公式D=1－ΣPi2(Pi為16S rDNA某基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比例，即第i個(gè)等位基因變異出現(xiàn)的頻率)計(jì)算出35株藥用黃芪根瘤菌遺傳多樣性指數(shù)D=0.916，表明該地區(qū)藥用黃芪根瘤菌具有豐富的遺傳多樣性。

2.2.2 主成分分析 應(yīng)用 NTSYS-pc(Versin 2.10e)軟件對(duì)49個(gè)菌株(斜莖黃芪35個(gè)供試菌株和14個(gè)參比菌株)16S rDNA-PCR的相似系數(shù)進(jìn)行主成分分析，用EIGEN程序作主成分之間的三維關(guān)系圖(圖4)，前3個(gè)主成分所能解釋的相關(guān)性分別為28.82%、16.54%和14.45%。主成分分析與16S rDNAPCR聚類(lèi)結(jié)果基本一致:26.SCAU568單獨(dú)分開(kāi)。群I:6.SCAU480，7.SCAU487，8.SCAU489;14.SCAU533;15.SCAU534;16.SCAU536;17.SCAU540;18.SCAU542;34.SCAU 609;24.SCAU550;25.SCAU551;27.SCAU591;33.SCAU597;群 II:30.SCAU 594;32.SCAU596;31.SCAU595;21.SCAU545;22.CAU546;群IV:1.SCAU470;2.SCAU471;3.SCAU472;4.SCAU473;5.SCAU474;群 V:11.SCAU516;12.SCAU517;13.SCAU519;群 VI:9.SCAU490;10.SCAU491;23.SCAU549。群 VII:19.SCAU543;22.SCAU546;45:R.etli CFN42。而35.SCAU611 與中慢生參比菌株 41:M.temperatum SDW 018T、42:M.tianshanense CCBAU 3306T、47:M.amorphae ACCC 19665T聚成群VIII;29.SCAU593在16SrDNA-RFLP中屬于 PhenonII，但在主成分分析中則與 28.SCAU592聚成群III。

圖5 藥用黃芪供試菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖Fig.5 Phylogenetic tree constructed by 16S rDNA sequences of tested strains

2.3 藥用黃芪根瘤菌16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)BOXAIR、16S rDNA-RFLP及PCA分析結(jié)果，選取20個(gè)代表菌株測(cè)定16S rDNA序列(北京華大基因科技股份有限公司)，構(gòu)建了供試菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖(圖5)。結(jié)果表明，20個(gè)代表菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖中分成2個(gè)大遺傳群:SCAU516、SCAU517、SCAU519、SCAU594、SCAU595、SCAU597、SCAU470、SCAU471 與 Rhizobium 聚群，其中，來(lái)自同一宿主的根瘤菌聚成一個(gè)小群。

其余供試菌株均聚在Rhizobium-Agrobacterium:SCAU 542、SCAU433、SCAU434、SCAU436、SCAU568形成一個(gè)獨(dú)立的分支;SCAU540、SCAU551、SCAU611、SCAU591、SCAU609、SCAU550 與 Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T形成一個(gè)小分支，表明這6個(gè)菌株與Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T的親緣關(guān)系很近;而SCAU596形成一個(gè)獨(dú)立的分支。

2.4 藥用黃芪根瘤菌抗逆性分析

對(duì)35個(gè)菌株分別進(jìn)行耐鹽性、初始pH生長(zhǎng)范圍及生長(zhǎng)溫度的測(cè)定。結(jié)果表明:27/35的菌株既能在4℃又能在45℃的恒溫條件下生長(zhǎng)，8/35的菌株能在1037℃的恒溫條件下生長(zhǎng)，所有菌株能在60℃(處理10 min后置28℃)條件下生長(zhǎng)。表明供試根瘤菌對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較寬，對(duì)溫度的耐受性表現(xiàn)出較大的多樣性。28/35的菌株能在pH 4～10的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，5/35的菌株能在pH 4～8的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而SCAU533、SCAU536僅能在pH6～8的范圍內(nèi)正常生長(zhǎng)。除12/35的菌株不能在1%NaCl的YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)外，多數(shù)(23/35)菌株能在2% ～8%NaCl的YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中，SCAU542、SCAU543、SCAU544、SCAU545、SCAU546等5個(gè)菌株能在8%NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

3 討論

35個(gè)菌株在16S rDNA PCR-RFLP分析中除SCAU549，SCAU568，SCAU596 單獨(dú)分開(kāi)外，其余菌株聚成4個(gè)遺傳群(相似系數(shù)83%);在BOXAIRPCR分析中則聚成6個(gè)遺傳群(相似系數(shù)84.6%)。很多在16S rDNA PCR-RFLP中具有相同遺傳類(lèi)型的菌株也有較大差異，因此，和16SrDNA PCRRFLP結(jié)果相比較，BOXAIR-PCR指紋圖譜分析揭示的遺傳信息更為豐富［9］

采用2種方法對(duì)35株藥用黃芪根瘤菌菌株和14個(gè)參比菌株進(jìn)行聚類(lèi)結(jié)果較為一致，均顯示:除少數(shù)供試菌株與參比菌株聚在一起外，其它供試菌株都獨(dú)自成群，表明大多數(shù)供試菌株和參比菌株間有較大的遺傳差異，藥用黃芪根瘤菌具有豐富的遺傳多樣性。是否預(yù)示著有潛在的新種，尚需進(jìn)行功能基因的分析。

16S rDNA序列分析是能較精確地揭示根瘤菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的一個(gè)重要手段［10］。16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果表明，分離自10種黃芪植物根瘤的35株藥用黃芪根瘤菌分別屬于Rhizobium(20/35株)、Ochrobactrum(3/35株)、Rhizobium-Agrobacterium(12/35株)。

在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖中，供試菌株 SCAU 542、SCAU433、SCAU434、SCAU436、SCAU568 聚在 Rhizobium-Agrobacterium: 而 SCAU540、 SCAU551、SCAU611、SCAU591、SCAU609、SCAU550 與 Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T形成一個(gè)小分支，顯示這6個(gè)菌株與Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T的親緣關(guān)系很近。這表明根瘤菌屬與土壤桿菌屬在種的系統(tǒng)發(fā)育上互有交叉，這與Kwon SW等的研究結(jié)果相一致［11］。

一般認(rèn)為，根瘤菌的最適生長(zhǎng)溫度為25～30℃，只有少數(shù)苜蓿根瘤菌菌株在42.5℃下生長(zhǎng)，極少數(shù)根瘤菌4℃條件下生長(zhǎng)，根瘤菌在60℃條件下處理5 min即全部被殺死。

對(duì)藥用黃芪根瘤菌供試菌株生長(zhǎng)溫度測(cè)定結(jié)果顯示，27/35的菌株既能在4℃又能在45℃的恒溫條件下生長(zhǎng)，8/35的菌株能在10～37℃的恒溫條件下生長(zhǎng)，所有菌株能在60℃(處理10 min后置28℃)條件下生長(zhǎng)。表明供試根瘤菌對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較寬，對(duì)溫度的耐受性表現(xiàn)出較大的多樣性。

根瘤菌生長(zhǎng)的最適pH 6～7。35個(gè)藥用黃芪根瘤菌菌株的宿主植物生長(zhǎng)的土壤pH 4～7.07之間，均屬酸性、中性偏酸環(huán)境，所有菌株均能在pH 4或5的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。其中，28/35的菌株能在pH 4～10的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，5/35的菌株能在pH 4～8的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而SCAU533、SCAU536僅能在pH6～8的范圍內(nèi)正常生長(zhǎng)。韋革宏等［12］對(duì)18株分離自陜甘寧地區(qū)5種黃芪植物(扁莖黃芪Astragalus complanulus，直立黃芪Astragalus adsurgens，糙葉黃芪Astragalus scubuerrumus，金翼黃芪Astragalus chrysupterus，內(nèi)蒙黃芪Astragalus mongulicus)根瘤菌的生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，全部供試菌株在pH 4～5的酸性環(huán)境中不能生長(zhǎng)，卻在pH11的堿性環(huán)境中能生長(zhǎng)，與其他來(lái)源的根瘤菌相比，它們具有較強(qiáng)的耐堿能力。表明根瘤菌適應(yīng)環(huán)境的能力是宿主植物、無(wú)機(jī)環(huán)境因子對(duì)菌株長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果。

影響微生物生長(zhǎng)的脅迫因素中，鹽分被認(rèn)為是最具危害性的非生物類(lèi)脅迫因素之一。除少數(shù)(12/35)的菌株不能在1%NaCl的YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)外，多數(shù)(23/35)菌株能在2% ～8%NaCl的YMA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中，SCAU542、SCAU543、SCAU544、SCAU545、SCAU546等5個(gè)菌株能在8%NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

川西高寒山區(qū)特殊的地理環(huán)境對(duì)生物進(jìn)行了長(zhǎng)期的自然選擇，使生長(zhǎng)在該地區(qū)的藥用黃芪根瘤菌既具有豐富的遺傳多樣性，又形成了與自然環(huán)境條件相適應(yīng)的耐高鹽、耐過(guò)酸過(guò)堿和耐高溫低溫的類(lèi)型，因此，研究高寒地區(qū)豆科植物根瘤菌的遺傳多樣性和抗逆性，能為選育具有優(yōu)良性狀的菌種提供資源。