李寧，帕提古麗·艾斯木托拉，楊生保，王柏柯，唐亞萍，楊濤，余慶輝

(新疆農業(yè)科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】辣椒(CapsicumannuumL.)，也可稱為番椒、辣茄等，隸屬茄科(solanaceae)，辣椒屬(C.apsicumL.)，主要產地分布于南北美洲、亞歐大陸以及大洋洲[1]。辣椒紅素作為目前銷售量最大的純天然的色素，被廣泛應用到各行各業(yè)中去。在國內農作物市場上，而每年辣椒紅素的產量大約是2 000 t[2]。新疆制干加工型辣椒年種植面積達3.5×104hm2，干椒年產量15×104～20×104t，辣椒成為新疆發(fā)展紅色產業(yè)的重要支柱作物。【前人研究進展】辣椒果實中的主要色素是辣椒紅素和辣椒玉紅，通過辣椒紅素-辣椒玉紅合酶(CCS)由辣椒特有的類胡蘿卜素路徑合成[3]。辣椒擁有高度進化的類胡蘿卜素合成路徑，前人采用基因克隆技術得到了辣椒紅素相關的部分基因，辣椒中尚未發(fā)現(xiàn)有哪個單基因突變可影響色素含量的差異[4]。對辣椒紅素的表觀遺傳及其調控機制缺乏系統(tǒng)研究。辣椒中胞嘧啶位點的甲基化是影響其外形的較為明顯的修飾形式，DNA甲基化能夠對作物的外表、生長發(fā)育的情況等其他方面產生重要的影響。經過大量的實驗，其結果和數據都能夠證明DNA甲基化在植物逆境脅迫響應以及生長等重要的生命進程有明顯的影響，DNA甲基化的發(fā)生還會引起基因沉默以及功能蛋白的缺失，導致于植物性狀發(fā)生改變[5-7]。MSAP(methylation-sensitive amplified polymorphism)法用以同裂酶HpaII和MspI當做高頻切割酶來取代AFLP(amplified fragment length polymorphism)中的MspI。其他遵循標準的AFLP分析[8]。在同裂酶(如HpaII和MspI)的眾多特性中，其能夠準確的分辨出序列中的甲基化，使得DNA進行不同的片段切割方式，產生出不同的切割片段來對甲基化位點進行表示[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于辣椒紅素表觀遺傳機制的研究仍未見報道，鮮見對辣椒果實發(fā)育過程中的DNA甲基化變化的研究。結合MSAP技術，研究不同品種辣椒果實發(fā)育過程DNA甲基化的狀態(tài)和模式的變化?！緮M解決的關鍵問題】以7月下旬到10月上旬2個取材時期的GB14和GB38兩個辣椒品種果實為研究對象，以DNA甲基化敏感擴增多態(tài)性(methylation sensiitve amplified polymorphism，MSAP)技術為基礎，對各時期辣椒果實基因組甲基化變化進行觀察和研究。并對甲基化表現(xiàn)呈多態(tài)性變化的8個片段回收、測序分析。為揭示辣椒紅素的表觀遺傳機制以及辣椒高紅素品種的選育奠定基礎理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

采用辣椒紅素低的GB14和辣椒紅素高的GB38兩個辣椒品種不同發(fā)育階段(綠熟期、紅熟期)的果實。引物(上海生工，中國)；植物總DNA提取試劑盒，純化試劑盒，DNA marker、克隆載體試劑盒，RNase-Free ddH2O，dNTP、10×buffer及內切酶均使用北京博邁德生物技術有限公司所生產的產品，而其余的實際都是分析純級別的試劑。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

采用北京博邁德植物總DNA提取試劑盒提取總DNA，將DNA溶于ddH2O中，進而對此進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計的實驗，在完成這兩項實驗之后將剩余溶液放入-20℃的冰箱中密封保存，以備下次實驗之用。

1.2.2 MSAP分析

甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)以Christoph等[8]的方法為基礎，進行適當的完善，再此試驗中使用EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ連個雙酶切組合。表1

酶切反應中，DNA樣本(200 ng/μl)2 μL，10×Buffer 4 μL(50 mM KAc，20 mM Tris-acetate，10 mM MgAc2，1 mM dTT 2 μL)，10 U/μLEcoRⅠ和HpaⅡ內切酶各0.8 μL，加水至20 μL，37℃保溫過夜。

在進行連接反應的過程中，在其實驗原料中酶切片中進行與人工設計的與EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ酶切位點互補的拼接工作，其中接頭連接體系為40 μL，20 μL酶切產物，10×T4 Buffer 4 μL，20 μM的EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ接頭各0.8 μL，5 U/μL連接酶2 μL，其余用水補齊，16℃過夜。

表1 用于MSAP分析的接頭和引物序列
Table 1 Adapters and primers used for MSAP analysis

接頭與引物Connectors and Primers引物序列 (5'-3')Primer sequenceEcoR I接頭EcoR I ConnectorsCTCGTAGACTGCGTACCAATTGGTACGCAGTCTACHM接頭HM ConnectorsGACGATGAGTCCTGAGCGCTCAGGACTCAT預擴增引物Pre-Amplified PrimerGACTGCGTACCAATTC(E00)GATGAGTCCTGAGCGG(HM00)選擇性擴增引物Selective Amplification PrimerGACTGCGTACCAATTCACC(E1)GACTGCGTACCAATTCACG(E2)GACTGCGTACCAATTCCAT(E3)GACTGCGTACCAATTCGTA(E4)GACTGCGTACCAATTCGTG(E5)GACTGCGTACCAATTCTCT(E6)GATGAGTCCTGAGCGGAGC(H1)GATGAGTCCTGAGCGGAGG(H2)GATGAGTCCTGAGCGGATC(H3)GATGAGTCCTGAGCGGCTC(H4)

預擴增反應體系為20 μL，其中含有酶切產物2 μL，10 mM dNTPs 0.4 μL、10×Buffer(25mM Mg2+)2 μL、5 U/μLTaq酶0.2 μL、10 μM E00-primer 0.5 μL、10 μM M00-primer 0.5 μL，其余用水補齊。反應條件為：94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，26個循環(huán)，在72℃的條件下進行10 min。將預擴增產物的溶劑稀釋20倍，以保證后續(xù)的實驗過程能夠順利完成。

選擇性擴增體系與預擴增體系相同。其PCR儀上設定的條件和過程是：在94和65℃到56℃之間分別持續(xù)30 s的時間，在72℃的時候持續(xù)1 min，其退火溫度在每個循環(huán)之后下降0.7℃，之后進行降式PCR擴增。在上述三個溫度段內往復進行23次，再在72℃延伸10 min。

將擴增PCR產物中假如適量的緩沖溶液，在94℃時，持續(xù)10 min使其充分的變性，之后把6%的變性聚丙烯酰胺凝膠加入到得到的溶液中去，進行垂直方向的電泳分析，之后在使用硝酸銀進行染色，在經過水的漂洗以及氫氧化鈉顯色等項目。在對得到的電泳條帶進行相應的分析。

1.2.3 特異性條帶回收測序

在上述實驗后獲得的聚丙烯酰胺凝膠上選取差異較大的條帶進行取樣，把樣品放入適當的容器中在放入20 μL的TE緩沖液(pH值8.0)，進行沸水浴，時間為10 min、等其完成沉淀之后，抽取3 μL的上清液作為對比對象。適應相同類型的引物和反應體系進行相同的實驗步驟，之后再用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離操作，最后同樣使用北京博邁德生物技術有效公司生產額純化試劑盒進行最后的實驗。完成此實驗后，將兩次實驗獲取的物質送往上海生工測序公司進行更較準確的測序。

2 結果與分析

2.1 DNA瓊脂糖檢測

在進行辣椒果實DNA質量檢測時使用0.8%的瓊脂糖，研究表明，在該DNA中，其結果是一條單帶，并且沒有講解現(xiàn)象的發(fā)生，在之后進行的紫外分光光度計試驗中證實了其DNA純度較高的猜想。圖1

圖1 辣椒果實DNA檢測結果
Fig.1 DNA test results of Capsicum fruit

2.2 PAGE電泳檢測結果

在進行了優(yōu)化預擴增反應體系后，預擴增產物進行50倍的稀釋操作，所得到的溶液取用1 μL作為實驗的對比對象，再取用10 μL進行接下來的實驗操作。共組合成24對引物進行篩選。在100～800 bp選擇擴增條帶致密、多態(tài)性高的引物組合。在現(xiàn)有的24對組合中，通過對比分析，選出4對較為有實驗價值的組合進行了MSAP檢測。表2

表2 24對選擇性擴增引物組合
Table 2 24 pairs of selective amplified primer combinations

引物編號Primer number引物組合Primer combination引物編號Primer number引物組合Primer combination引物編號Primer number引物組合Primer combinationP1E1H3P9E3H3P17E4H3P2E1H4P10E3H4P18E4H4P3E1H1P11E3H1P19E4H1P4E1H2P12E3H2P20E4H2P5E2H3P13E5H3P21E6H3P6E2H4P14E5H4P22E6H4P7E2H1P15E5H1P23E6H1P8E2H2P16E5H2P24E6H2

圖2 兩個辣椒品種的果實發(fā)育不同時期DNA甲基化電泳
Fig.2 DNA methylation electrophoresis of two capsicum cultivars in different developmental stages

表3 辣椒基因組DNA甲基化修飾位點序列Blast分析
Table 3 Results of blast analysis of gene methylation modified loci of capsicum genome

序列同源序列一致性E值登錄號Pep-1PREDICTED: Capsicum annuum ABC transporter G family member 6(LOC107871342),mRNA99%0XM_016718249.1Pep-2PREDICTED:Capsicum annuum uncharacterized LOC107871923(LOC107871923),mRNA85%1.00E-91XM_016718770.1Pep-3Capsicum annuum clone BAC CaCM414G15,complete sequence74%5.00E-28GU048885.1Pep-4PREDICTED: Capsicum annuum uncharacterized LOC107864630(LOC107864630),transcript variant X5,miscRNA81%5.00E-88XR_001672686.1Pep-5Capsicum annuum clone BAC CaCM303O04,complete sequence74%6.00E-31GU048883.1Pep-6PREDICTED: Capsicum annuum putative disease resistance RPP13-like protein 1(LOC107847616),mRNA99%6.00E-91XM_016691985.1Pep-7Capsicum annuum cultivar Jeju mitochondrion,complete genome91%6.00E-27KJ865410.1Pep-8PREDICTED: Capsicum annuum serine/threonine-protein kinase Nek6-like (LOC107843669),transcript variant X1,mRNA98%3.00E-37XM_016688036.1

2.3 測序結果

對10個辣椒基因組DNA甲基化修飾位點進行了相關的操作之后，得到了8條DNA甲基化修飾位點的核苷酸序列。使用BLASTn對此8條核苷酸序列進行分析，辣椒基因組DNA中有轉錄調控因子(Pep-5)、反轉錄轉座子(Pep-3)、跨膜蛋白(Pep-5)、選擇性剪切體(Pep-4、Pep-5)、通道蛋白(Pep-9)、蛋白激酶(Pep-3)、葡萄糖基轉移酶(Pep-4)等多種類型的DNA序列中假定蛋白(Pep-2、Pep-3、Pep-4、Pep-5、Pep-8)、核糖體蛋白(Pep-6)、硫氧還蛋白(Pep-2)、均存在甲基化修飾現(xiàn)象[9]。表3

2.4 甲基化類型

辣椒果實DNA經HpaII/EcoRI(H)和MspI/EcoRI酶切后會生成四種不同的甲基化類型，這四種甲基化類型可以通過聚丙烯酰胺凝膠進行電泳實驗而得到，這四種甲基化類型可以分為一下幾種情況：類型I(TypeI)、類型II(TypeII)、類型III(TypeIII)、在這三種情況下，類型I可以表示非甲基化，在H和M用到都有條帶的形成，而其余兩種分別可以表示單鏈甲基化和雙鏈甲基化，其條帶也分別可以在H和M用到上看到，而且III類型在M泳道上的條帶為對各時間點采集的有野的MSAP條帶統(tǒng)計。兩種辣椒果實綠熟期和紅熟期的基因組單鏈甲基化(TypeII)類型條帶數分別為880、885、904、916，雙鏈甲基化(TypeIII)類型條帶數分別為為155、164、168、184，而超甲基化類型(TypeIV)條帶數分別為64、74、28和24?？傮w甲基化比例公式為MSAP%=(TypeII+TypeIII+TypeIV)/(TypeI+TypeII+TypeIII+TypeIV)%[11]，在此基礎上，可以知道，兩種辣椒果實綠熟期和紅熟期基因組總體甲基化比例分別為36.51%、36.38%、35.57%和35.45%。兩種辣椒果實綠熟期和紅熟期，在擴增的甲基化位點變化的過程中，基因組DNA的甲基化與果實發(fā)育時間呈反比，當其時間越長，其總體的甲基化比例就會下降。表4

表4 辣椒果實發(fā)育不同時期下DNA甲基化水平
Table 4 Effects of the DNA methylation levels in different stages of capsicum fruit development

甲基化類型Methylation type不同時間點采集的甲基化譜帶統(tǒng)計Methylation bands statistics in Different time points collected samples(%)GB14綠熟期GB38綠熟期GB14紅熟期GB38紅熟期類型1 Type I880885904916類型2 Type II155164168184類型3 Type III287268303295類型4 Type IV64742824

Note：TypeI：representsnon-methylated，typeII：representssingle-strands methylated，typeIII：represents double-strands methylated，TypeIV：represents super-methylated

3 討 論

基因的甲基化作為一種重要的表觀遺傳調控方式，在高等植物的基因組表達調控中發(fā)揮著重要作用。辣椒是一種非模式植物，針對辣椒基本開展的各種與基因相關的研究還沒有取得突破性的進展。在試驗中，針對辣椒果實在著色成熟的過程中進行了細致的研究，同時發(fā)現(xiàn)在此過程中DNA甲基化修飾發(fā)生了巨大的變化。兩種辣椒果實在不同發(fā)育階段對比，GB14和GB38辣椒果實的綠熟期和紅熟期的總體甲基化水平依次分別是36.51%、36.38%、35.57%和35.45%，GB14的果實甲基化水平在紅熟期不斷降低。而在GB38的果實生長至成熟的過程中，CCGG位點的半甲基化迅速升至較高的水平，在64.5%處發(fā)生了停頓，與此同時全甲基化位點的百分比為13.21%。

有研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化不僅參與植物生長發(fā)育調控并在植物逆境脅迫響應中發(fā)揮作用[12]，而且在樹木年齡效應中也具有重要的調控作用。任茂等[13]對棉花高溫脅迫誘導，發(fā)現(xiàn)高溫能夠誘導棉花甲基化水平的提高，同時棉花耐熱性高低與DNA甲基化水平及狀態(tài)變化存在重要關系。李廷春等[14]對紫玉米生長發(fā)育過程MSAP分析結果顯示，紫玉米籽粒在授粉后，DNA半甲基化條帶和全甲基化條帶的百分比與玉米粒的生長發(fā)育呈正比例的關系，而且甲基化發(fā)生的區(qū)域并沒有明確的劃分。Bitonti等[15]針對桃子也開展了DNA甲基化對植物自身影響的實驗，實驗發(fā)現(xiàn)，通過對DNA中甲基化程度的干預，可以實現(xiàn)控制植物生長周期記憶果實成熟的目的。DNA甲基化水平對于植物的生長有重要的作用[16-17]。在實驗中，GB14和GB38兩個不同品種的果實在不同發(fā)育階段DNA甲基化水平變化也不同，推測辣椒種群分化及物種進化也與DNA甲基化水平有關。

MSAP體系中包括了對于基因的提取、酶切、連接等程序。較好的電泳圖譜是試驗獲得成功的重要前提條件；而酶切反應是該體系的關鍵操作，好的酶切反應操作可以幫助科研人員獲得較為清晰的條帶及相關資料。酶切試驗被給予了充分的反應時間，酶連產物用量關系到預擴增產物濃度，會影響后續(xù)操作；預擴增產物不僅可以當做選擇性擴增的模板來使用，同時還可以對模板進行純化，所以在進行溶液稀釋的時候要謹慎小心，同時此操作對于整個實驗也有至關重要的作用。

4 結 論

辣椒紅素低的GB14和辣椒紅素高的GB38的果實在不同發(fā)育階段對比，兩種辣椒果實的綠熟期和紅熟期的總體甲基化水平依次分別是36.51%、36.38%、35.57%和35.45%，對比兩個品種的辣椒生長過程，對甲基化中8個片段進行研究，DNA的甲基化的發(fā)生不受編碼區(qū)和非編碼區(qū)的限制，在這兩種區(qū)域中都有可能發(fā)生。