胡紅梅 廖家萬(wàn) 李偉 曾常愛(ài)

牙髓微環(huán)境中具有分化潛能的細(xì)胞可在信號(hào)分子的誘導(dǎo)下發(fā)生分化并形成修復(fù)性牙本質(zhì)。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是由Gronthos等[1]于2000 年提出的概念，在牙組織修復(fù)過(guò)程中起著重要作用。DPSCs在增殖過(guò)程中一些信號(hào)通路被激活，其中較為重要的是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)家族的p38-MAPK和其下游基因信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)，Lee等[2]和Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)p38-MAPK和STAT3參與了DPSCs 向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，并介導(dǎo)牙髓干細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞的分化指標(biāo)堿性磷酸酶活性具有調(diào)控作用，但是其中的具體分子機(jī)制并不清楚。本實(shí)驗(yàn)探討了微氧化應(yīng)激下p38-MAPK信號(hào)通路和STAT3信號(hào)靶點(diǎn)對(duì)DPSCs增殖和分化的分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與主要儀器

DPSCs(保存于井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實(shí)驗(yàn)室)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國(guó))；CCK-8試劑盒(Sigma，美國(guó))；PVDF膜(Bio-Rad，美國(guó))；ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(PIERCE，美國(guó))；TEMED(Amersham Pharmacia Biotech，美國(guó))；胰蛋白酶、蛋白裂解液(碧云天)；SB203580、AG490(Selleck，美國(guó))；Trans-Blot?SD Cell半干轉(zhuǎn)儀、電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))；脫色搖床(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；圖像分析系統(tǒng)(LabworksTM Analysis Softwar，美國(guó))；GDS8000凝膠掃描系統(tǒng)(UVP，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 DPSCs微氧模型建立 DPSCs進(jìn)行復(fù)蘇，置培養(yǎng)板于無(wú)菌密閉容器，進(jìn)氣口通入含3%O2，92%N2，5%CO2混合氣體，經(jīng)出氣口流出，使容器內(nèi)保持微氧狀態(tài)，在此條件下培養(yǎng)細(xì)胞到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后進(jìn)行檢測(cè)收樣。實(shí)驗(yàn)分組情況：1組：常氧組(空氣，21%O2)；2組：常氧組+SB203580抑制(終濃度為20 μmol/L)；3組：常氧組+AG490(終濃度為65 μmol/L)；4組：微氧組；5組：微氧組+SB203580抑制(終濃度為20 μmol/L)；6組：微氧組+AG490(終濃度為65 μmol/L)。加藥處理組需在微氧前加入終濃度為20 μmol/L的SB203580抑制劑或者是加入終濃度為65 μmol/L的AG490抑制劑，然后再進(jìn)行微氧處理。

1.2.2 CCK8檢測(cè)DPSCs增殖 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代DPSCs，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml，待DPSCs貼壁以后，按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)空，將培養(yǎng)板分別置于常氧箱和缺氧箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)DPSCs至12、24、36 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡)，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值，同時(shí)設(shè)置空白孔(培養(yǎng)基、CCK)，對(duì)照孔(未經(jīng)處理的DPSCs、培養(yǎng)基、CCK)。

1.2.3 礦化結(jié)節(jié)形成檢測(cè) 用濃鹽酸調(diào)節(jié)PBS溶液pH至4.2，稱取1 g茜素紅溶于100 ml中的溶液中，完全溶解，培養(yǎng)細(xì)胞貼壁以后，按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，PBS漂洗，4%多聚甲醛處理，茜素紅染液，雙蒸水沖洗，干燥，封片。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞周期 收集1～5×105DPSCs，加入1 ml冰浴預(yù)冷70%乙醇中，吹打混勻，4 ℃固定2 h，離心，沉淀細(xì)胞，吸除上清，加入0.5 ml碘化丙啶染色液，用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。

1.2.5 QRT-PCR檢測(cè)人DPSCs中ALP表達(dá) ALP引物設(shè)計(jì)由上海生工合成，其ID:249，hALPF：GTGGCAACTCTATCTTTGGTCTG，hALPR：CGCCTGGTAGTTGTTGTGAGC，長(zhǎng)度158 bp；內(nèi)參基因hactinf：TGACGTGGACATCCGCAAAG，hactinr：CTGGAAGGTGGACAGCGAGG，長(zhǎng)度205 bp。提取RNA，將RNA 沉淀溶解于適量(20～50 μl)的無(wú)RNase水中。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配制(總體積20 μl)：2×RT buffer 10 μl，6 N隨機(jī)引物(100 pmol/μl) 1 μl，RT-mix 1 μl，模板(RNA) 5 μl，DEPC水3 μl，條件的設(shè)置：25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min；熒光定量PCR反應(yīng)體系的配制：(總體積50 μl)，2×PCR buffer 25 μl，Primers(25 pmol/μl)1 μl×2，Sybr green I(20*)0.5 μl，模板*(cDNA)2 μl，DEPC水20.5 μl，熒光定量PCR擴(kuò)增條件的設(shè)置：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循環(huán)35 次，72 ℃檢測(cè)信號(hào)。

1.2.6 WB檢測(cè)人DPSCs中 PCNA表達(dá) 首先總蛋白提取，使用分光光度計(jì)測(cè)定562 nm處的吸光度值，測(cè)定時(shí)，使用1 ml比色皿，用ddH2O校零，盡可能在20 min內(nèi)檢測(cè)完畢所有樣品，各濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值減去Blank值的平均值，繪制 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，SDS-PAGE電泳，電泳條件:120 V，10 min，200 V，30 min，將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面依次墊海綿墊、濾紙、膠、PVDF膜(經(jīng)甲醇活化)、濾紙、海綿墊，同時(shí)將電泳液換成轉(zhuǎn)移液，取出膜，并做好正反面標(biāo)記，在TBST中清洗1 min，然后用5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h，用封閉液將對(duì)應(yīng)的一抗稀釋成一定的濃度(1∶500)，內(nèi)參一抗的稀釋終濃度為1∶1 000，然后溫育1.5 h或4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST洗3 次，每次5 min，用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度(1∶1 000)，然后溫育1.5 h，曝光檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 DPSCs形態(tài)學(xué)觀察

DPSCs在培養(yǎng)21 d 后，倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形并貼壁生長(zhǎng)，傳代后的細(xì)胞增殖迅速且呈漩渦狀排列，部分可出現(xiàn)集落生長(zhǎng)，集落間細(xì)胞分散，形狀類似成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞較大，培養(yǎng)21 d的光鏡照片，放大倍數(shù)為100 倍，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭型，融合成單層細(xì)胞(圖 1)。各組之間的細(xì)胞形態(tài)都呈長(zhǎng)梭型，常氧各個(gè)組的細(xì)胞數(shù)量較密集，數(shù)量較多，微氧各個(gè)組的細(xì)胞相對(duì)數(shù)量較少，差別比較明顯。

圖 1 6組培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)

2.2 CCK8檢測(cè)牙髓干細(xì)胞增殖活性的結(jié)果

DPSCs在微氧微環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，較其在常氧微環(huán)境中生長(zhǎng)的吸光度值低，尤其在培養(yǎng)36 h后更加明顯，在12、24 h 各微氧組的光吸收度值變化幅度較?。欢Ｑ踅M吸光度值增加較多(圖 2)，在36 h時(shí)抑制p38-MAPK時(shí)變化較明顯，經(jīng)SPSS 17.0分析，各微氧組的光吸收度值與常氧組的光吸收度值相比，在24、36 h均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，顯示常氧環(huán)境下抑制p38-MAPK時(shí)更能促進(jìn) DPSCs細(xì)胞的增殖，而微氧環(huán)境下抑制STAT3致細(xì)胞增殖不明顯，而且在各組牙髓干細(xì)胞不同時(shí)間段存活率顯示(表 1)，常氧環(huán)境及常氧環(huán)境下抑制p38-MAPK時(shí)DPSCs細(xì)胞的存活率也較高，且與各組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖 2 各組DPSCs生長(zhǎng)曲線圖

2.3 礦化結(jié)節(jié)的形成情況

各微氧組及常氧組DPSCs均見(jiàn)橘紅色礦化結(jié)節(jié)(即鈣結(jié)節(jié))形成(圖 3)，其中微氧各個(gè)組形成的礦化結(jié)節(jié)大小及數(shù)量較多，尤其微氧且抑制STAT3組顯示有大量的細(xì)胞礦結(jié)節(jié)，常氧組抑制p38-MAPK組的細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)較少，且細(xì)胞數(shù)量也較少。提示微氧環(huán)境可以更好的促進(jìn)牙齒硬組織的形成，STAT3信號(hào)分子和p38-MAPK通路的激活在牙齒硬組織的形成中可能存在相反的作用。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) DPSCs增殖周期情況

微氧各組和常氧各組的DPSCs的細(xì)胞周期、二倍體水平的流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表 2和圖 4。由圖可見(jiàn)，當(dāng)DPSCs在常氧且抑制p38-MAPK通路時(shí)，在各組中細(xì)胞分裂最為旺盛；當(dāng)DPSCs在微氧且抑制STAT3信號(hào)分子時(shí)，在各組中細(xì)胞分裂最不明顯，通過(guò)SPSS 17.0軟件分析，微氧且抑制STAT3信號(hào)分子組和其它各組的細(xì)胞分裂指數(shù)(PI)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說(shuō)明 DPSCs體外培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)微環(huán)境為常氧時(shí)，不論是抑制p38-MAPK通路還是STAT3信號(hào)分子時(shí)，都可以明顯促進(jìn)細(xì)胞的分裂。

表 1 6 組DPSCs不同時(shí)間段存活率

表 2 6 組DPSCs增殖周期的影響

注：①第6組與其它組比較,P<0.05

2.5 QRT-PCR檢測(cè)DPSCs中ALP表達(dá)情況

各組的DNA溶液作為模板進(jìn)行QRT-PCR 擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增效率均在R2=0. 997 8，均方差=0.095 3，斜率-3.417 7，截距=46.422 6，說(shuō)明擴(kuò)增效率接近100%，提示不同梯度定量模板的對(duì)數(shù)值與循環(huán)數(shù)之間，相關(guān)關(guān)系較好，證明數(shù)據(jù)可靠性較高。表 3顯示微氧組和微氧且抑制STAT3組的相對(duì)比值明顯高于其它組，證明mRNA表達(dá)多，即ALP表達(dá)情況較高，通過(guò)單因素方差分析P<0.05，說(shuō)明這幾組之間的差別是有顯著性。熔解曲線分析結(jié)果顯示目的基因熔解曲線如圖 5所示，ALP PCR產(chǎn)物以及標(biāo)準(zhǔn)品(內(nèi)參)均在大于84 ℃以上獲得單一熔解峰，說(shuō)明在該反應(yīng)條件下，擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物溶解溫度較均一，目的基因具有很好的特異性，反應(yīng)體系良好。

圖 3 6 組的細(xì)胞茜素紅染色

圖 4 流式細(xì)胞分析圖

表 3 ALP Q-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)

注：①第6組及第4組與其它組比較,P<0.05

圖 5 ALP擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖 6 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖 7 Westernblot檢測(cè)PCNA蛋白的表達(dá)

2.6 WB檢測(cè)人DPSCs中PCNA表達(dá)

標(biāo)準(zhǔn)曲線的R值為0.995 3，說(shuō)明本次曲線擬合度較好。通過(guò)DPSCs的蛋白質(zhì)含量Western blot檢測(cè)以及灰度值發(fā)現(xiàn)，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，各組均檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，顯示常氧環(huán)境下抑制p38-MAPK時(shí)積分光密度較高，而微氧環(huán)境下抑制STAT3致積分光密度較低，說(shuō)明常氧且抑制p38-MAPK時(shí)細(xì)胞增值率高，而微氧且抑制STAT3時(shí)細(xì)胞增值率低，且與各組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 6～7，表 4)。

表 4 PCNA蛋白條帶灰度值分析

3 討 論

有關(guān)DPSCs增殖、分化的組織調(diào)控內(nèi)外環(huán)境因素比較復(fù)雜，為了達(dá)到組織工程化應(yīng)用的目的，國(guó)內(nèi)一些學(xué)者進(jìn)一步開拓了研究視野[4-5]。但是目前DPSCs大多是在體外氧張力為(18%～21%O2)的空氣中培養(yǎng)，細(xì)胞沒(méi)有受到自身牙髓中的微環(huán)境的控制，因此DPSCs的增殖分化效果難以評(píng)估。Kim等[6]認(rèn)為微氧環(huán)境下細(xì)胞表現(xiàn)出生長(zhǎng)速度加快，集落增多；Dos等[7]也認(rèn)為氧濃度降低有助于維持細(xì)胞的活性，但有學(xué)者卻認(rèn)為持續(xù)性微氧環(huán)境抑制細(xì)胞增殖，低氧不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖能力受抑制、細(xì)胞周期停滯在G1期及侵襲能力降低[8-9]。因此本次實(shí)驗(yàn)選擇了培養(yǎng)微氧組的DPSCs和常氧組的DPSCs來(lái)研究其中的差異，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過(guò)程中常氧組的細(xì)胞數(shù)量較密集，數(shù)量較多，微氧各個(gè)組的細(xì)胞相對(duì)數(shù)量較少，常氧環(huán)境中生長(zhǎng)的DPSCs吸光度值更高，進(jìn)一步研究細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)常氧組的目標(biāo)蛋白表達(dá)較微氧組高，可以明顯促進(jìn)DPSCs的增殖，而微氧組DPSCs增殖不明顯。由于細(xì)胞的增殖與分化受各種生長(zhǎng)因子和其相應(yīng)的受體組成的精密有序的信號(hào)通路網(wǎng)控制，p38-MAPK通路在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的作用，STAT3也廣泛表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織中，參與細(xì)胞生長(zhǎng)，凋亡等功能的調(diào)控。因此我們采取抑制p38-MAPK通路和STAT3來(lái)進(jìn)一步研究DPSCs的增殖和分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)環(huán)境為常氧且分別抑制p38-MAPK通路和STAT3時(shí)，p38-MAPK通路明顯抑制DPSCs的增殖，STAT3信號(hào)分子促進(jìn)DPSCs的增殖；在微氧且抑制p38-MAPK通路和STAT3時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與常氧環(huán)境竟然一致，由于STAT3是p38-MAPK的下游基因，研究結(jié)果提示p38-MAPK通路抑制可能激活STAT3信號(hào)分子，導(dǎo)致DPSCs的大量增殖，但是其中的具體分子機(jī)制并不清楚。在細(xì)胞的分化研究中，發(fā)現(xiàn)微氧組的細(xì)胞礦結(jié)節(jié)和更高的ALP表達(dá)，提示在微氧環(huán)境下DPSCs的分化能力更強(qiáng)，更能促進(jìn)牙齒硬組織的形成。Lennon等[10]認(rèn)為大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在低氧條件下，成骨能力會(huì)增強(qiáng)，Grayson[11]表達(dá)了相似的觀點(diǎn)，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也一致。同時(shí)在微氧且抑制STAT3組顯示有大量的細(xì)胞礦結(jié)節(jié)和更高的ALP表達(dá)，常氧且抑制p38-MAPK組的細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)較少，且細(xì)胞數(shù)量也較少，ALP表達(dá)，而且微氧組抑制STAT3組的相對(duì)比值明顯高于其它組，證明mRNA表達(dá)多，即ALP表達(dá)情況較高，提示p38-MAPK通路在常氧和微氧環(huán)境下對(duì)DPSCs分化都起到促進(jìn)作用，STAT3信號(hào)分子在常氧和微氧環(huán)境下對(duì)DPSCs分化都起到抑制作用。

綜上所述，DPSCs在微氧環(huán)境下的增殖效果較差，但是分化能力更強(qiáng)，更能促進(jìn)牙齒硬組織的形成，而且p38-MAPK通路抑制DPSCs的增殖，對(duì)DPSCs分化起到促進(jìn)作用，STAT3信號(hào)分子促進(jìn)DPSCs的增殖，對(duì)DPSCs分化起到抑制作用，對(duì)于p38-MAPK通路和STAT3信號(hào)分子之間在DPSCs的增殖和分化中的協(xié)同作用將進(jìn)一步研究。