羅浩 徐佩瓊 鄭治國(guó)

根管再治療術(shù)是常規(guī)根管治療失敗后保存患牙的首選治療手段[1]，其目的為徹底清除填充物質(zhì)及感染病灶，恢復(fù)根尖周及牙周組織的健康狀態(tài)[2]。根管再治療術(shù)成功的關(guān)鍵在于對(duì)根管系統(tǒng)的徹底清理及對(duì)原有根管形態(tài)的最大限度的保護(hù)[3]。其中，根管再治療術(shù)的第一步為充分去除患牙根管的充填材料。因此如何選擇恰當(dāng)?shù)姆椒?，能夠保護(hù)原有根管系統(tǒng)的同時(shí)去除根充材料，成為根管再治療領(lǐng)域研究的重點(diǎn)課題。

目前根管在治療術(shù)中去除根充材料應(yīng)用的方法包括物理和化學(xué)方法。其中化學(xué)方法是指在去除根充材料時(shí)輔助使用氯仿、二甲苯、乙二胺四乙酸(EDTA)等有機(jī)溶劑溶解牙膠尖，使根充材料更容易取出。氯仿作為最常用的有機(jī)溶劑應(yīng)用于根管再治療中，由于其有一定的生物毒性，故臨床應(yīng)用受到爭(zhēng)議[4]。近年來(lái)，橙油作為一種相對(duì)安全有效的有機(jī)溶劑逐步應(yīng)用于根管再治療的臨床應(yīng)用中[5]。然而，橙油等有機(jī)溶劑對(duì)牙周及根尖周組織是否存在一定的細(xì)胞毒性尚無(wú)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)及噻唑藍(lán)比色法(MTT)觀(guān)察不同濃度的橙油對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs)的細(xì)胞毒性，并與氯仿及桉樹(shù)油進(jìn)行對(duì)比，為橙油作為清除根充材料有機(jī)溶劑的臨床應(yīng)用提供安全性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

橙油、氯仿、桉樹(shù)油(Formula &A??o Farmácia, 巴西)；胎牛血清(fetal calf serum,FBS)(Gibco，美國(guó))；酶標(biāo)儀Model-680(Bio-Rad公司，美國(guó))；I型膠原酶、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))；溴化-3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)、胰蛋白酶(Sigma,美國(guó))；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus公司，德國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(Leica公司，德國(guó))；純水系統(tǒng)Milli-Q(Millipore公司，美國(guó))；電子天平BL-6(Sartorius公司，德國(guó))；生物安全柜Hfsafe900(Heraeus公司，德國(guó))；壓力蒸汽滅菌器(Sanyo公司，日本)。

1.2 hPDLFs的采集及培養(yǎng)

hPDLFs收集自12～18 歲正畸患者因正畸需要而拔除的前磨牙。刮取牙根中1/3處的牙周膜，剪成0.5 mm2塊，均勻置于培養(yǎng)瓶底，各組織間隔3 mm，置于37 ℃、5%CO2、100%濕度的恒溫孵育箱培養(yǎng)，隔天換液。待細(xì)胞爬滿(mǎn)瓶底75%～80%時(shí)傳代：吸去培養(yǎng)液，PBS漂洗3 次以防止胎牛血清影響胰蛋白酶的消化作用。用 0.25%的胰蛋白酶消化1 min，倒置顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞收縮變圓、胞體透亮、細(xì)胞之間間隙增大時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。吹打細(xì)胞并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管，離心(1 000 r/min,5 min)后倒去上清液，加入適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1.0×105個(gè)/ml密度接種于培養(yǎng)皿中，完成第一次傳代。取第4～6代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組培養(yǎng)細(xì)胞

分別將橙油、桉樹(shù)油及氯仿用含10%胎牛血清的DMEDM培養(yǎng)基配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%和1%的稀釋液備用。細(xì)胞消化后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔2 000 個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板，每孔體積200 μl；接種24 h觀(guān)察細(xì)胞貼壁后更換為0.1%及1%有機(jī)溶劑培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)照組換液為含10%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；同一培養(yǎng)條件，培養(yǎng)1～12 h，于1、6及12 h檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。

1.4 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)1、6及12 h后，每孔加MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h，終止細(xì)胞生長(zhǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 hPDLFs形態(tài)特征

倒置顯微鏡下觀(guān)察可見(jiàn)，細(xì)胞呈星形或長(zhǎng)梭型，核圓形或橢圓形，有2～4 個(gè)胞質(zhì)突，核仁清晰可見(jiàn)，呈現(xiàn)出典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)(圖 1)。符合hPDLFs的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)[6]。

圖 1 hPDLFs形態(tài)特征 (×20)

2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：①在培養(yǎng)1、6及12 h后，hPDLFs數(shù)量逐漸增多，獲取的人牙周膜干細(xì)胞具有良好的增殖性能；②較低濃度(0.1%)的有機(jī)溶劑橙油、桉樹(shù)油及氯仿對(duì)hPDLFs的增殖無(wú)顯著影響，在低濃度下3 種有機(jī)溶劑均未表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性；③1%濃度的有機(jī)溶劑橙油、桉樹(shù)油及氯仿均表現(xiàn)出對(duì)hPDLFs增殖的抑制作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且隨接觸時(shí)間延長(zhǎng)該抑制作用呈現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢(shì)；④在3 種有機(jī)溶劑中，橙油對(duì)hPDLFs的抑制性顯著低于桉樹(shù)油及氯仿，且在1、6及12 h時(shí)間節(jié)點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖 2)。

圖 2 應(yīng)用不同濃度橙油、桉樹(shù)油及氯仿培養(yǎng)第1、6和12 h時(shí)，hPDLFs的增殖活性檢測(cè)(*:與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與1%橙油組比較，P<0.05)

3 討 論

選用恰當(dāng)?shù)姆椒ㄈコ軆?nèi)填充物是提高根管再治療成功率的重要環(huán)節(jié)[7]，但根管系統(tǒng)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)使根管內(nèi)充填物難以徹底去除[8]?；瘜W(xué)有機(jī)溶劑的正確使用能夠有效溶解根管內(nèi)牙膠尖等充填物，提高醫(yī)生的臨床操作效率[9]。本研究針對(duì)橙油、桉樹(shù)油及氯仿3 種臨床常用有機(jī)溶劑對(duì)人牙周膜干細(xì)胞的毒性進(jìn)行研究和探討，初步明確了在所討論的3 種有機(jī)溶劑中，橙油具有相對(duì)較低的細(xì)胞毒性，可作為根管再治療的安全有機(jī)溶劑，本實(shí)驗(yàn)為橙油的臨床應(yīng)用提供參考。

現(xiàn)階段根管再治療臨床工作中，氯仿以其高溶解性作為最有代表性的有機(jī)溶劑之一。自1976 年美國(guó)藥品食物管理局(FDA)禁止在藥品和化妝品配方中添加氯仿以來(lái)，氯仿在根管再治療中的使用備受爭(zhēng)議[10]。除諸多研究證實(shí)氯仿具有致癌作用外[11]，Lee等[12]研究證實(shí)氯仿可通過(guò)調(diào)節(jié)JNK和ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)性疾病。故而，氯仿作為有機(jī)溶劑具有一定的臨床應(yīng)用局限性，近年來(lái)隨著材料工程技術(shù)的進(jìn)步出現(xiàn)了一系列有機(jī)溶劑替代品。桉樹(shù)油和橙油具備較為優(yōu)良的臨床可操作性能，具有相對(duì)較好的有機(jī)溶解性能。Julia等[13]以蒸餾水作為對(duì)照組，比較了桉樹(shù)油、橙油及氯仿的溶解特性，結(jié)果證實(shí)，桉樹(shù)油及橙油具有與氯仿相似的溶解性能。該研究結(jié)果提示，根管再治療過(guò)程中使用桉樹(shù)油和橙油亦有可能達(dá)到溶解根充材料的目的。然而，有關(guān)3 種有機(jī)溶劑對(duì)牙周及根尖周組織是否具有傷害性作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

在根尖周牙周組織中，hPDLFs是最為主要的細(xì)胞成分之一，也是牙周膜的主要功能細(xì)胞[14]。hPDLFs參與牙周膜纖維的破壞與修復(fù)，是參與牙周組織改建與修復(fù)的重要成分之一[15]。在根管治療與根管再治療過(guò)程中，牙周膜細(xì)胞行使了重要的組織修復(fù)功能。本次試驗(yàn)通過(guò)噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)了橙油、桉樹(shù)油及氯仿對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，3 種有機(jī)溶劑中，橙油對(duì)hPDLFs增殖性能影響最小，桉樹(shù)油與氯仿影響較大且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果提示，與桉樹(shù)油及氯仿相比，橙油具有相對(duì)安全的特性，對(duì)hPDLFs增殖情況影響較小，有可能作為氯仿的臨床替代產(chǎn)品，從而減輕根管再治療過(guò)程中由于化學(xué)有機(jī)溶劑的使用造成的二次創(chuàng)傷，有望減輕根管再治療中的患者臨床反應(yīng)，并在一定程度上提高醫(yī)生診治效率。進(jìn)一步可探討橙油、桉樹(shù)油對(duì)hPDLFs作用的分子機(jī)制及其生物安全性，為臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。