鄧詠梅 王輝 何松霖 胡德渝 王金華

脂質(zhì)體是主要由脂質(zhì)分子和(或)磷脂分子組成的雙分子層膜。1971年英國(guó)Sessa等[1]將脂質(zhì)體用作藥物載體以來(lái)，因其具有一定程度的靶向性、緩釋性,能降低藥物給藥劑量,減輕藥物毒性,提高不穩(wěn)定藥物的穩(wěn)定性，在醫(yī)藥領(lǐng)域的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，在醫(yī)藥界得到了日益廣泛的關(guān)注。隨著研究的發(fā)展，粒徑更小的納米脂質(zhì)體(nanoliposomes)被認(rèn)為是最理想的脂質(zhì)體藥物載體。

米諾環(huán)素制劑作為局部用藥輔助治療牙周炎已有很久的歷史，其效果已得到肯定?，F(xiàn)在應(yīng)用于牙周炎輔助治療的米諾環(huán)素劑型有：鹽酸米諾環(huán)素緩釋膜、2%米諾環(huán)素軟膏、2%米諾環(huán)素凝膠和米諾環(huán)素可吸收性微球。米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體輔助治療牙周炎的研究正處于起步階段，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察一種新型米諾環(huán)素制劑-以納米脂質(zhì)體為載體合成的鹽酸米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的治療效果，為臨床應(yīng)用鹽酸米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 模型建立及分組

選取無(wú)齲壞和牙周病的5周齡雌性SD大鼠110 只，體重(192.5±20.05) g(四川大學(xué)華西動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。采用直徑0.2 mm正畸鋼絲結(jié)扎實(shí)驗(yàn)牙牙頸部+齦溝內(nèi)接種牙齦卟啉單胞菌+喂食10%的葡萄糖水建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型。將建模成功的78 只大鼠隨機(jī)分成3 組(n=26)。陽(yáng)性對(duì)照組(簡(jiǎn)稱O組)采用2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏治療，實(shí)驗(yàn)組(簡(jiǎn)稱N組)采用2%鹽酸米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體治療，陰性對(duì)照組(簡(jiǎn)稱S組)只給予0.9%生理鹽水。

1.2 給藥及觀察時(shí)間

每組每周牙周袋內(nèi)給藥1 次，連續(xù)56 d。動(dòng)物飼養(yǎng)在24 ℃恒溫實(shí)驗(yàn)室。分別在給藥7、28、56 d后檢查實(shí)驗(yàn)大鼠的牙齦指數(shù)(gingival Index，GI)、探診深度(probing depth，PD)，并于各觀察期每組分別處死6 只進(jìn)行組織學(xué)觀察。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，給藥與指標(biāo)測(cè)量由2 個(gè)不同實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立完成。

1.3 觀察指標(biāo)

牙齦指數(shù)(gingival index，GI)：采用Loe與Silness 1967 年修訂的檢查方法[2]探診深度(probing depth，PD)：測(cè)量牙齦緣至牙周袋底或齦溝底的深度。檢查左上頜第一磨牙腭側(cè)近中，腭側(cè)正中，腭側(cè)遠(yuǎn)中，求取平均值。

組織學(xué)觀察：選擇包埋較好的3 個(gè)蠟塊，每個(gè)蠟塊選取1 張包含3 個(gè)磨牙在內(nèi)的組織切片，在40×0.65顯微鏡下連續(xù)攝取4 張矩形數(shù)碼照片，手工挑出單核細(xì)胞及破骨細(xì)胞并計(jì)數(shù)。其它內(nèi)容：牙齦上皮位置，新纖維，新骨的形成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Epidata 3.1錄入數(shù)據(jù)，SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。主要運(yùn)用的統(tǒng)計(jì)方法有：統(tǒng)計(jì)描述、方差分析以及T檢驗(yàn)等，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取0.05。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的建立

建模21 d后，測(cè)得84 只實(shí)驗(yàn)大鼠GI和PD為(2.550±0.594)、(1.593±0.177) mm。處死6 只大鼠進(jìn)行組織學(xué)觀察，可見(jiàn)左上頜第一磨牙腭側(cè)牙齦重度紅腫，上皮與牙面分離，第一、二磨牙間牙齦乳頭紅腫，個(gè)別可見(jiàn)潰瘍出現(xiàn)。結(jié)合上皮處有潰瘍形成,上皮與牙面分離，上皮根向增殖，上皮病變以破壞為主，袋內(nèi)上皮糜爛，袋內(nèi)可見(jiàn)細(xì)菌團(tuán)塊；上皮下及牙周組織中單核細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，牙周纖維破壞明顯；牙槽骨吸收明顯，可見(jiàn)較多的破骨細(xì)胞及陷窩(圖 1)。說(shuō)明大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型建立成功。78 只SD大鼠體重(172.5±10.22) g。

2.2 視覺(jué)指標(biāo)

給藥7 d后，檢查實(shí)驗(yàn)大鼠的牙齦指數(shù)，N、O組略低于基線水平，S組略高于基線水平，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.137,P=0.872)，且N組與O組和S組相比亦無(wú)明顯差異(t=0.263，P=0.794；t=0.525，P=0.603)。實(shí)驗(yàn)大鼠的探診深度，N、O組也略低于基線水平，S組略高于基線水平，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.137,P=0.872)，且N組與O組和S組相比亦無(wú)明顯差異(t=0.835，P=0.409；t=1.622，P=0.113)(表 1)。

表 1 實(shí)驗(yàn)各時(shí)期牙周指數(shù) (n=6)

注：①與基線比較，P<0.05；②與S組比，P<0.05；③與O組比，P<0.05

給藥28 d后，已能觀察到2%鹽酸米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體對(duì)治療大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的作用。

給藥56 d后，2%鹽酸米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體和2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏對(duì)治療大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎都有效，而2%鹽酸米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體效果更好。

2.3 組織學(xué)指標(biāo)

給藥7 d后，3 組大鼠牙周炎均無(wú)明顯變化。3 組牙齦上皮位置變化不明顯，牙槽骨未見(jiàn)明顯變化(圖 1)，但實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞亦無(wú)明顯變化(表 2)。

給藥28 d后，陽(yáng)性對(duì)照組牙周炎改善不明顯，牙齦上皮的位置向冠方移動(dòng)，未見(jiàn)明顯的新纖維形成，牙槽嵴頂未見(jiàn)繼續(xù)吸收；實(shí)驗(yàn)組牙周炎開(kāi)始好轉(zhuǎn)，牙齦上皮的位置向冠方移動(dòng)幅度較大，可見(jiàn)少量新纖維生成，已吸收的牙槽骨未見(jiàn)新骨形成；陰性對(duì)照組牙周炎加重，牙齦上皮繼續(xù)根方增殖，牙槽嵴頂吸收至根尖1/3(圖 1)。表 2顯示給藥28d后2%鹽酸米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體和2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏均使牙周組織中單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞減少，表明對(duì)治療大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎都有作用。

圖 1 組織學(xué)觀察 (HE, ×100)

表 2 實(shí)驗(yàn)各時(shí)期單核細(xì)胞與破骨細(xì)胞比較 (n=6)

注：①與基線比較，P<0.05；②與S組比，P<0.05 ；③與O組比，P<0.05

給藥56 d后，陽(yáng)性對(duì)照組牙周炎開(kāi)始好轉(zhuǎn)，牙齦上皮接近于正常位置，可以看見(jiàn)新纖維的形成，已吸收的牙槽骨未見(jiàn)到明顯的新骨形成；實(shí)驗(yàn)組牙周炎明顯好轉(zhuǎn)，牙齦上皮基本恢復(fù)正常，可見(jiàn)較多新纖維的形成，已吸收的牙槽嵴頂可見(jiàn)新生牙槽骨；陰性對(duì)照組牙周炎進(jìn)一步加重牙齦上皮繼續(xù)根方增殖，纖維紊亂，斷裂，牙槽嵴頂繼續(xù)吸收，到根尖處(圖 1)。且實(shí)驗(yàn)組單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)比陽(yáng)性對(duì)照組更低(t=6.882，P=0.000；t=5.997，P=0.000)(表 2)。說(shuō)明給藥56 d后2%鹽酸米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體治療大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的效果比2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏更好。

3 討 論

牙周病是由齦上菌斑引起的細(xì)菌感染而導(dǎo)致的局部炎性反應(yīng)[3]，牙周致病菌分泌有害物質(zhì)和酶將直接或間接觸發(fā)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)而引起自身?yè)p害[4]。新興的牙周病治療觀念是阻斷造成組織破壞的宿主反應(yīng)及細(xì)菌的有害作用，四環(huán)素類藥物被證實(shí)有抗菌及調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的作用。

本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組均觀察到GI、PD、單核細(xì)胞、破骨細(xì)胞顯著降低。與陰性對(duì)照組比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組織學(xué)觀察可見(jiàn)新纖維，新骨的形成，而陰性對(duì)照組隨著時(shí)間延長(zhǎng)牙周炎進(jìn)一步加重，這是因?yàn)閮山M實(shí)驗(yàn)藥物的有效成分均為鹽酸米諾環(huán)素，其對(duì)牙周炎有治療作用，而陰性對(duì)照組藥物中無(wú)對(duì)牙周炎有治療作用的成分。

鹽酸米諾環(huán)素作為一種合成的四環(huán)素，其具有較強(qiáng)的抗菌作用，能明顯地抑制致牙周病細(xì)菌，還可誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞的凋亡，抑制破骨細(xì)胞的生成，促進(jìn)成骨。Gomes等[5]的外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)基中長(zhǎng)期使用250 ng/ml的鹽酸米諾環(huán)素可以顯著抑制破骨細(xì)胞的形成。5 μg/ml鹽酸米諾環(huán)素在24 h內(nèi)也能夠明顯誘導(dǎo)成熟20 d以上破骨細(xì)胞的凋亡。Somerman等[6]研究發(fā)現(xiàn)20 mg/ml的鹽酸米諾環(huán)素可以增強(qiáng)牙齦成纖維細(xì)胞附著于塑料界面。Rompen等[7-8]觀察到用2.5%鹽酸米諾環(huán)素處理牙本質(zhì)界面可以增強(qiáng)牙齦成纖維細(xì)胞的附著。覆蓋傷口的細(xì)胞的遷移是牙周愈合中牙周組織再生的另一重要影響因素。鹽酸米諾環(huán)素可以誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)的絲狀偽足伸展，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移。Babich等[9]實(shí)驗(yàn)顯示：50 mg/ml的米諾環(huán)素可以使S-G細(xì)胞遷移至牙周愈合。

脂質(zhì)體是主要由脂質(zhì)分子和磷脂分子組成的封閉的連續(xù)的雙層結(jié)構(gòu)[10-11]，與細(xì)胞膜十分相似。脂質(zhì)體具有淋巴系統(tǒng)趨向性，組織靶向性，易被吞噬細(xì)胞攝取，提高藥物療效，減少藥物用量和毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，可作為抗生素等藥物的載體應(yīng)用于臨床[12]。納米脂質(zhì)體,即小單室脂質(zhì)體,是粒徑為小于100 nm的一類單室脂質(zhì)體。其作為藥物載體，具有脂質(zhì)體同樣的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)由于其生物相容性好，藥物可迅速的從牙周袋內(nèi)吸收至牙齦組織中及深部牙周感染組織[13]。

本實(shí)驗(yàn)中,陽(yáng)性對(duì)照組藥物為2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏[14]，是緩釋抗菌藥物，雖能大大提高牙周袋內(nèi)鹽酸米諾環(huán)素的濃度，但由于緩釋劑中藥物釋放速度不穩(wěn)定，通常在其置入袋內(nèi)2～3 d內(nèi)釋放出80%～90%的鹽酸米諾環(huán)素，隨后釋放速度變慢，藥物濃度明顯下降，致使牙周袋內(nèi)藥物濃度波動(dòng)較大，不利于感染的控制。而試驗(yàn)組藥物是以納米脂質(zhì)體為載體，不僅具有上述的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)其屬于控釋制劑，可使鹽酸米諾環(huán)素在預(yù)定時(shí)間內(nèi)自動(dòng)按某一速度從劑型中以恒定的速度釋放于牙周袋內(nèi)，使牙周袋內(nèi)的藥物濃度較長(zhǎng)時(shí)間恒定地維持在有效濃度范圍內(nèi)，延長(zhǎng)鹽酸米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體的有效作用時(shí)間。因此，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組藥物更容易到達(dá)已經(jīng)破壞的牙周袋深部，且在牙周袋內(nèi)的藥物濃度更高，有效作用時(shí)間更長(zhǎng)。所以，實(shí)驗(yàn)組在給藥28 d后就可以觀察到GI,PD，單核細(xì)胞數(shù)目，破骨細(xì)胞數(shù)目明顯降低，且能見(jiàn)到少量新纖維的形成，說(shuō)明被破壞的牙周組織已經(jīng)開(kāi)始修復(fù)。而陽(yáng)性對(duì)照組牙周炎僅單核細(xì)胞數(shù)目，破骨細(xì)胞數(shù)目明顯降低，卻不能看見(jiàn)新纖維形成，牙周組織未出現(xiàn)明顯的修復(fù)。由于藥物持續(xù)作用，給藥56 d后，實(shí)驗(yàn)組組GI、PD繼續(xù)顯著降低，只見(jiàn)到少許單核細(xì)胞，偶見(jiàn)破骨細(xì)胞，見(jiàn)到新骨形成，大量新纖維的形成，說(shuō)明已經(jīng)破壞的牙周組織大部分已得到修復(fù)。而陽(yáng)性對(duì)照組雖然GI、PD、單核細(xì)胞、破骨細(xì)胞數(shù)目明顯降低，但降低幅度小于實(shí)驗(yàn)組，僅見(jiàn)少量新纖維的形成，未見(jiàn)到明顯的新骨形成，組織修復(fù)程度明顯弱于實(shí)驗(yàn)組,與徐燕等[15]研究結(jié)果相符。

在本實(shí)驗(yàn)中，由于SD大鼠牙周袋較小，未行牙周潔刮治及根面平整術(shù)，若在臨床試驗(yàn)中配合潔刮治及根面平整術(shù)，鹽酸米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體輔助治療牙周炎的效果可能更加顯著。

牙齦的炎癥和牙周袋形成是牙周炎最重要的病理改變。牙齦指數(shù)可以反映牙齦炎癥的程度，客觀簡(jiǎn)便，廣泛用于臨床療效評(píng)價(jià)；牙周探診是牙周病最重要的檢查方法，其中探診深度可以反映牙周袋深度的變化，袋深者炎癥較重。而組織學(xué)觀察提供結(jié)果觀察的金標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)中采用GI、PD及組織學(xué)觀察共同觀察藥物的治療效果，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度高。在為期2 月的實(shí)驗(yàn)中，2%鹽酸米諾環(huán)素納米脂質(zhì)體及2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏均能有效改善大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎，且前者的治療效果優(yōu)于后者，具有臨床應(yīng)用前景。